中医不同治法对大鼠心肌缺血再灌注损伤后细胞凋亡的影响

谭元生，雍苏南，唐 莹，张 稳

（湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

中医不同治法对大鼠心肌缺血再灌注损伤后细胞凋亡的影响

谭元生，雍苏南，唐 莹，张 稳

（湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

目的 观察中医不同治法补气、活血、化痰对大鼠心肌缺血再灌注（I/R）诱导细胞凋亡及凋亡相关基因Bc1-2、Bax和氧自由基含量的影响。方法 建立大鼠动脉粥样硬化在体心肌缺血再灌注模型，采用原位末端TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数（AI），链酶亲和素-生物素-酶复合物(SABC)免疫组化法检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax蛋白表达，常规方法检测丙二醇（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性。结果 与I／R组比较，中医补气、活血、化痰法均能降低AI，有效清除氧自由基，差异有统计学意义（P＜0.01）；与I／R组比较，其中活血法和化痰法均能上调Bc1-2表达、下调Bax表达，差异有统计学意义（P＜0.01），最终达到保护I／R心肌的目的。结论 中医不同治法补气、活血、化痰可能通过不同途径预防I／R心肌细胞发生凋亡，从而对I／R心肌具有保护作用。

心肌缺血再灌注损伤；补气法；活血法；化痰法；保元汤；血府逐瘀汤；瓜蒌薤白半夏汤；基因表达；氧自由基；大鼠

缺血性心脏病是严重危害人类健康的常见疾病之一，其基本的治疗原则是恢复血流再灌注。但尽管血流恢复再灌注，心肌损伤反有加重，我们称这种现象为心肌缺血再灌注损伤 (myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)。 随着治疗缺血性心脏病的新技术、新疗法在临床的发展和应用，MIRI出现的几率将更大，因而其防治尤显重要。MIRI参与因素众多，机制复杂，中医学的整体观辨证论治特色对此有其特有的优势，中医药在防治MIRI及其并发症方面具有很大潜力。本文在动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）大鼠心肌缺血再灌注损伤模型上，从分子水平探讨补气、活血、化痰不同中医治法拮抗MIRI细胞凋亡机制的异同，对临床治疗缺血性心脏病提出新的观点。现将实验方法及结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康雄性wistar大鼠50只，体质量（270±25）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。 许可证号：SCXK（沪 2007-0008）。

1.1.2 药物 补气法选择保元汤（黄芪、人参、肉桂、甘草）；活血法选用血府逐瘀汤（桃仁、红花、当归、生地、川芎、赤芍、牛膝、桔梗、柴胡、枳壳、甘草）；化痰法选用瓜蒌薤白半夏汤（瓜蒌、薤白、半夏、白酒）。所有药材均购自湖南中医药大学第一附属医院中药房。

1.1.3 仪器 Micro-ESR型电子自旋共振波谱仪，美国产；TD5-Ⅱ台式离心机，长沙平凡仪器仪表有限公司生产；721分光光度计，上海第三仪器厂生产；SSW型电热恒温水槽，上海博迅实业有限公司提供；Thermo Shandon切片机，英国产；LKB-Ⅱ型超薄切片机，瑞典产；OPTON万能光学显微镜，德国产；H-600透射电镜，日本产。

1.1.4 试剂 原位细胞凋亡检测试剂盒、Bcl-2、Bax免疫组化检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD),丙二醛（malondialdehyde,MDA)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备及分组 参照参考文献[1]的方法，制备高脂乳剂，对50只wistar大鼠按10 mL/kg灌胃，每日1次，连续12周。随机抽取2只大鼠，处死后速取主动脉，浸入4%多聚甲醛溶液中，固定48 h，石蜡包埋切片，HE染色，光学显微镜下观察发现已形成粥样硬化斑块，提示造模成功。随机分成5组，即假手术组（sham 组）、IRI模型组(I／R 组)、补气法组（BQ组）、活血法组（HX组）、化痰法组（HT组），每组10只动物。在大鼠AS模型的基础上，手术建立大鼠MIRI模型：大鼠称质量后氯胺酮80 mg/kg经腹腔注射麻醉。气管切开接呼吸机人工呼吸，记录Ⅱ导联心电图。开胸后以左冠状静脉主干为标志结扎左冠状动脉。以心电图ST段明显抬高、结扎点远端心肌发绀为结扎成功标志。结扎冠状动脉左前降支30 min，复流3 h。sham组只穿线不结扎冠脉。

1.2.2 药物的制备及给药方法 保元汤、血府逐瘀汤、瓜蒌薤白半夏汤分别为水煎剂按照参考文献[2]制备；给药剂量均按60 kg成人与动物体表面积换算，保元汤以生药0.95 g/kg，血府逐瘀汤以生药1.37 g/kg，瓜蒌薤白半夏汤以生药0.59 g/kg，给药体积均按1 mL/100 g计算，于缺血再灌注前30 min给大鼠灌胃，缺血再灌注组给予等量生理盐水。

1.2.3 心肌凋亡细胞原位检测 采用末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)介导的dUTP-生物素平移末端标记技术-TUNEL法(TdT-mediated dUTP end labeling)标记凋亡心肌细胞。具体操作步骤是切片常规脱蜡入水，新鲜配制3% H2O2，室温处理10 min，蒸馏水洗涤2 min×3次；标本片加0.1 M TBS 1∶200新鲜稀释 Proteinase K 37℃消化12 min，0.1 M TBS洗2 min×3次；标本片加标记缓冲液20 μL／片，以保持切片湿润；按每张切片取TdT 和 DIG-dUTP 各1 μL， 加入 18 μL 标记缓冲液中，混匀；甩去多余液体后加标记液20 μL／片，置于湿盒中37℃标记2 h；0.1 M TBS洗2 min×3次，加封闭液5 μL／片，室温3 μL后甩掉封闭液；用封闭液1∶100稀释生物素化抗地高辛抗体，5 μL／片加至标本片上，置于湿盒中37℃反应30 min，0.1 M TBS 洗 2 min×3 次；取 1 mL 0.1 M TBS加SABC 10 μL，混匀后加至切片，37℃反应60 min，0.1 M TBS洗 5 min×4次 。 DAB 显 色30 min，水洗：苏木素轻度复染，0.1 M TBS洗，蒸馏水洗，脱水，透明，封片，光学显微镜观察结果。上述步骤中每组各选1张切片不加TdT酶(加等量蒸馏水)作为阴性对照。细胞核中有棕黄色颗粒者为凋亡阳性细胞。每张切片随机于×400物镜下取5个视野，每组共40个视野，计数凋亡阳性细胞，以凋亡指数(Apoptosis Index，AI)反映各组心肌细胞凋亡的情况。AI=视野内凋亡细胞个数／视野内所有心肌细胞个数×100%。

1.2.4 Bcl-2、Bax基因蛋白表达的检测 采用链酶亲和素-生物素-酶复合物(strept avidin-biotin complex，SABC)免疫组化检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax蛋白表达。主要步骤：切片脱蜡入水→新配1%H2O2溶液封闭内源性POD 10 min→分别加入Bc1-2、Bax蛋白抗体，4℃过夜→PBS(pH 7.4)漂洗→加生物素化二抗37℃孵育2 h→加SABC 37℃孵育30 min→DAB显色→苏木素复染→光镜观察。上述步骤中不加一抗、二抗作为阴性对照。胞浆着棕黄色者为阳性表达细胞。在光镜下200倍放大，通过图像分析系统每张切片随机选取10个视野，测定阳性染色的平均光密度与阳性细胞百分比，计算蛋白阳性表达指数 (positive expression index，PEI)：PEI=平均光密度×阳性细胞百分比×100，并求出Bax／Bcl-2的比值。

1.2.5 氧自由基的检测 采用电子共振自旋波频谱仪定量检测心肌细胞氧自由基量。用黄嘌呤氧化酶法检测血清SOD活性，用硫代巴比妥(TBA)法检测MDA含量。

1.3 统计学分析

所有数据使用SPSS 14.0 for windows统计软件进行数据分析，各组间比较采用方差分析（ANOVA），组间两两比较采用最小显著差值法（LSD），给药前、后比较采用配对t检验。采用“”表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对各组大鼠心肌细胞凋亡指数的影响

光镜下观察，Sham组偶见凋亡阳性细胞，I／R组有大量的心肌细胞凋亡，且积聚成团，AI显著高于sham组（P＜0.01）。BQ组、HX组及HT组心肌细胞凋亡数均较I／R组明显减少（P＜0.01）。见表1。

2.2 对各组大鼠Bcl-2与Bax基因蛋白表达的影响

在sham组中，Bcl-2、Bax蛋白表达量都较少，Bax/Bcl-2比值接近 1；与 sham组比较，I／R组Bc1-2蛋白和Bax的表达量均有所上升(P<0.01)，但以Bax蛋白表达更明显，Bax／Bc1-2显著增高 (P<0.01)；与I／R组比较，BQ组 Bc1-2和 Bax的表达量无明显上升 (P＞0.05)；HX组、HT组与 I／R组比较，Bc1-2蛋白的表达量显著升高 (P<0.01)，Bax蛋白的表达量则明显下降(P<0.01)，Bax／Bc1-2也显著低于I／R 组(P<0.01)，见表 1。

表1 各组大鼠AI及凋亡相关蛋白的变化（n＝10，）

表1 各组大鼠AI及凋亡相关蛋白的变化（n＝10，）

注：与 sham 组比较 #P＜0.01；与 I／R 组比较△P＜0.01。

组 别sham组I／R 组BQ组HX组HT组药物剂量(g/kg)— —0.95 1.37 0.59 AI(%)3.2±0.7 30.6±7.1#15.8±5.6#△16.4±6.2#△16.9±5.3#△Bc1-2蛋白0.24±0.03 7.42±2.13#7.44±2.08#16.87±4.92#△17.68±4.85#△Bax蛋白0.22±0.04 18.24±5.49#18.14±5.41#5.84±1.14#△5.43±1.21#△Bax/Bcl-2 0.89±0.33 3.23±0.10#3.26±0.11#0.34±0.58#△0.31±0.61#△

2.3 对各组大鼠心肌SOD、MDA含量的影响

sham组心肌组织的SOD具有较高的活性，MDA处于较低的水平。I／R组同sham组比较，则有明显的氧化趋势，SOD活性显著降低 (P<0.01)，MDA含量显著增高 (P<0.01)；3种中医治法组同I/R组比较，MDA含量均明显降低 (P<0.01)，SOD活性均显著增高(P<0.01或 P<0.05)；其中补气法和活血法在降低MDA含量、升高SOD活性方面优于化痰法，其差异有统计学意义（P＜0.05)。 见表 2。

表2 各组大鼠心肌 SOD、MDA 含量的变化（n＝10，）

表2 各组大鼠心肌 SOD、MDA 含量的变化（n＝10，）

注：与 sham 组比较 #P＜0.01；与 I／R 组比较△P＜0.01；与BQ 组比较※P＜0.05。

组 别sham组I／R 组BQ组HX组HT组药物剂量(g/kg)— —0.95 1.37 0.59 SOD（mkat/g）2.75±0.30 1.35±0.16#2.21±0.25#△2.19±0.27#△1.80±0.24#※MDA（μmol/g）5.94±1.23 17.21±2.48#7.84±1.71#△7.91±1.82#△9.52±1.64#△※

3 讨论

心肌缺血再灌注损伤是急性心肌梗死早期再灌注治疗过程中一个严重的并发症。研究发现，再灌注损伤发病机制中一个重要的环节是心肌细胞凋亡。本实验结果表明，心肌缺血再灌注后凋亡明显增多，而使用3种不同中医治法的方药后凋亡细胞明显减少，说明补气、活血、化痰3种中医治法均可预防心肌细胞凋亡。在心肌缺血／再灌注损伤中，凋亡的发生是受细胞周围的刺激信号诱导或抑制，并由特定的基因控制。MIRI中产生的自由基，细胞内钙超载等均是促进细胞凋亡的诱导因素。这些因素并不直接引起细胞凋亡，而是通过一定的信号传递方式激活生存或死亡相关基因，然后将信号传递到核内切酶，而执行死亡的功能。细胞凋亡由细胞内凋亡相关基因直接控制，Bax蛋白基因与Bc1-2蛋白基因具有高度的同源序列，Bax蛋白与Bc1-2蛋白可相互结合形成结合体，过度表达Bax蛋白可促进细胞凋亡并抑制Bcl-2蛋白的抗凋亡作用。因此，Bax蛋白和Bc1-2蛋白表达的比例决定细胞是生存还是凋亡。本实验发现sham组中Bcl-2和Bax及凋亡细胞表达很少，而I/R组Bcl-2蛋白表达增加，有报道认为与心肌细胞受到缺血再灌注过程的刺激而反应性表达，以提高细胞的内在抵抗能力有关[3]；但Bax蛋白表达更多，Bax蛋白／Bcl-2蛋白比值增大，凋亡细胞增多，这进一步证明了Bax／Bcl-2比值与细胞凋亡的密切关系；给予3组不同治法的方药治疗后，HX组和HT组Bc1-2表达上调，Bax表达下调，Bax／Bcl-2比值下降，而BQ组的Bax和Bc1-2表达无明显改善，提示活血法、化痰法可上调Bcl-2蛋白表达，下调Bax蛋白的表达，抑制心肌细胞的凋亡，以减轻心肌缺血再灌注损伤，而补气法可能从其他分子途径拮抗MIRI。

心肌细胞内氧自由基大量产生是再灌注心肌损伤发病的重要机制之一。超氧化物歧化酶(SOD)是体内存在的一种抗氧自由基酶,其活力的高低间接反应了机体清除氧自由基(OFR)的能力[4]，MDA为OFR发生脂质过氧化反应过程中形成的脂质过氧化物,其水平间接反应了机体细胞受自由基攻击的严重程度。两者的变化可反映心肌的抗氧化能力[5]。本实验显示：与I／R组比较，3个中药治疗组大鼠在经历I／R后，其SOD活性均明显增高，MDA含量均明显降低，提示中医补气、活血、化痰法均能够有效清除氧自由基，提高机体抗氧化能力。但HT组在增高SOD活性及降低MDA含量方面均无BQ组、HX组明显，说明中医补气、活血、化痰法均能通过促进清除大鼠心肌细胞I／R时所产生的氧自由基，减轻在体大鼠I／R心肌细胞凋亡，但化痰法清除氧自由基的作用效果不及补气法和活血法。

本实验表明，补气、活血、化痰3种中医治法均能有效预防MIRI后的细胞凋亡，其中活血、化痰法主要通过清除氧自由基，上调Bc1-2蛋白表达、下调Bax蛋白表达，最终达到保护I／R心肌的目的；补气法则主要通过清除氧自由基来预防I／R心肌细胞发生凋亡，减轻I／R损伤。而关于补气、活血、化痰这3种治疗缺血性心脏病常用中医治法对I／R心肌细胞凋亡影响的其他分子机制有待进一步探讨。

[1]刘 明，董超仁，苏静怡.一种简便实用的大鼠高脂模型[J].中国药理学通报，1989，5（2）：119.

[2]李仪奎.中药药理实验方法学[M].上海：上海科技出版社，1991：36.

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（本文编辑 彭芝配）

Effect of different treatments in TCM on myocyte apoptosis in myocardial ischemia reperfusion in rats

TAN Yuan-sheng， YONG Su-nan，TANG Ying，Zhang Wen
(First Affiliated Hospital,TCM University of Hunan,Changsha,Hunan 410007,China)

Objective To observe the effect of different treatments in TCM on myocyte apop tosis and expression of Bc1-2 and Bax and the content of oxygen free radicals in myocardial is chemiareperfusion in rats.Method The rats models in vivo of atherosclerosis myocardial is chemia reperfusion were stablished,the apoptosis index(AI)was detected withTUNEL method in situ end method,the apoptos is related genes Bcl-2Chain and Bax protein expression with avidin-bi otin-enzyme complex(SABC)immunohistochemical method,and the activity ofsuperox ide dismutase(SOD)and the content of malondialdehyde(MDA)with routine method.Results Compared with I/R group,all the treatments in TCM could reduce AI and remove effectively the oxygen free radicals（P＜0.01）,the activating blood and resolving phlegm methods could reduce the content of MDA and increase the activity of SOD and decrease Bax expression（P＜0.01）,and then,protect 1/R cardiac muscle.Conclusion The different treatments in TCM can restrain the apoptosis of I／R cardiac muscle cells and to protect consequently the I／R cardiac muscle.

book=146,ebook=146

apoptosis;benefiting Qi therapy;activating blood therapy;resolving phlegm therapy;Baoyuan decoction;Xuefu Zhuyu decoction;Gualou Xiebai Banxia decoction;gene expression;oxygen free radicals;rats

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2010.11.005.018.04

2010-11-08

湖南省教育厅科研项目（06C624）。

谭元生（1962-），男，湖南益阳人，医学博士，主任医师，教授，博士研究生导师，主要从事心血管疾病的中医药防治研究。