蒲黄黄酮对缺氧损伤血管内皮细胞的保护作用

林 洁 ，贾春燕 ，王若光 ，王 璇 ，肖艳娟 ，叶 赞

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学2007级研究生班，湖南 长沙 410208；3.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；4.湖南中医药大学2006级研究生班，湖南 长沙 410208）

蒲黄黄酮对缺氧损伤血管内皮细胞的保护作用

林 洁1，贾春燕2，王若光3，王 璇4，肖艳娟4，叶 赞4

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学2007级研究生班，湖南 长沙 410208；3.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；4.湖南中医药大学2006级研究生班，湖南 长沙 410208）

目的 研究蒲黄黄酮对缺氧损伤血管内皮细胞人脐静脉内皮细胞（HUVE-12）活性、内皮素(ET)、一氧化氮(NO)含量的影响。方法 缺氧诱导血管内皮细胞损伤，MTT比色法观察蒲黄黄酮对血管内皮细胞的影响，酶联免疫法测定细胞培养液中内皮素－1（ET-1）、NO的含量。结果 蒲黄黄酮可提高缺氧时HUVE-12细胞活性，减少NO降低程度（P<0.05），抑制ET-1的生成（P<0.05），蒲黄黄酮对HUVE-12细胞的这种保护作用与其浓度存在一定的量效关系。结论 蒲黄黄酮对缺氧损伤的血管内皮细胞HUVE－12具有保护作用，其作用可能与NO和ET-1的生成有关。

蒲黄黄酮；血管内皮细胞；缺氧损伤；保护性作用

蒲黄，为香蒲科植物（Typhaceae）水烛香蒲、东方香蒲或其它同属植物的花粉。具有活血化瘀、止血消肿、排脓生肌、通淋等功效。蒲黄历来为众多医家用来治疗妇科疾病如经期腹痛，产后出血，产后疼痛，且疗效显著，实为妇科良药。前期研究中提示蒲黄黄酮具有雌激素样效应，雌激素对血管内皮细胞的保护作用已经证实[1]，故本次实验利用体外培养的方法来验证蒲黄黄酮对血管内皮细胞保护作用，探明蒲黄黄酮保护血管内皮细胞的作用机制，进一步阐明蒲黄的类雌激素效应。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 蒲黄黄酮乙醇提取浸膏，生药含量为1.6%，由湖南中医药大学药学院制备提供。阳性对照药17-β雌二醇，由美国Sigma公司提供。

1.1.2 细胞 人脐静脉内皮细胞株HUVE-12，引自湘雅细胞中心。

1.1.3 仪器 全自动酶标仪（MK3）购自芬兰LABSYSTEMS集团，紫外分光光度仪（UU-754）上海第三分析仪器厂，倒置显微镜（XDS-1B）购自重庆光学仪器厂。

1.1.4 试剂 DMEM培养基、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑蓝(MTT)，购于美国Sigma公司。小牛血清，购自湘雅细胞中心。二甲基亚砜(DMS0)，购于索莱宝科技有限公司。NO检测试剂盒（南京建成科技有限公司），人内皮素1（ET-1）ELISA检测试剂盒（RD）。

1.2 方法

1.2.1 HUVE-12细胞的培养及分组 将人脐静脉内皮细胞HUVE-12培养于DMEM培养液中，其中含 10%小牛血清，青霉素 100 U／mL，链霉素100／mL，37 ℃，5%CO2培养箱中培养，按 2.5×104个细胞／孔的细胞密度接种于96孔板，继续培养24 h，待HUVEC-12细胞生长呈亚融合状态时分成6组，分别在不同条件下培养（n=5）即：蒲黄黄酮150μg/mL细胞组（简称高剂量组）、蒲黄黄酮100μg/mL细胞组（简称中剂量组）、蒲黄黄酮50μg/mL细胞组（简称低剂量组）、17-β雌二醇10-8mol/L细胞组（简称阳性对照组）、正常培养细胞组（简称正常组）、缺氧组（单纯缺氧培养细胞，不加任何药物干预）。

1.2.2 缺氧装置的建立 参照文献[2－3]的方法，将盛有HUVEC-12细胞的96孔培养板放入1个密闭的玻璃干燥器皿中，并在玻璃器皿中点燃1支蜡烛，立即盖好玻璃器皿盖，并用凡士林封口，待蜡烛熄灭后将玻璃器皿连同96孔培养板一同放入37℃，5%CO2培养箱中缺氧培养4 h。

1.2.3 血管内皮细胞毒性试验 以MTT法检测蒲黄黄酮对血管内皮细胞毒性。参照文献[4]，以每孔2.5×104个/mL细胞浓度接种于96孔培养板中，用DMEM培养液配制成不同浓度的蒲黄黄酮药液，实验时弃去细胞培养液，分别向孔中加入不同浓度的药液200 μL，每个浓度组设重复孔5个，空白对照组每孔加入200 μL不含ICA的DMEM培养液。37℃，CO2培养箱培养48 h。终止培养前每孔加入MTT(最终浓度0.5 mg／mL)，37 ℃，5%CO2培养4h。弃去上清液，每孔内加入DMSO 200 μL，静置10 min。在酶标仪570 nm下测定各孔吸光度值。

1.2.4 内皮细胞抑制率检测 观察HUVE-12内皮细胞大体形态；测定内皮细胞抑制率；检测NO、ET-1的含量，具体检测方法参照试剂盒说明书。

2 结果

2.1 蒲黄黄酮对HUVE-12细胞形态的影响

正常组HUVE-12细胞饱满，大小均匀，胞核较清晰，边缘清晰，细胞透亮，呈铺路石样紧密排列（见图1①）。缺氧组的HUVE-12细胞呈多角形，细胞轮廓明显不清，细胞膜严重肿胀，细胞核界限不清，核周围可见深色颗粒和空泡，视野内可见到多处细胞碎片（见图1②）。蒲黄黄酮高、中剂量组和阳性对照干预组细胞轮廓与正常组比较形态欠清晰，细胞核界限欠清，但与单纯缺氧组比较细胞肿胀程度轻（见图1③～⑤）。蒲黄黄酮低剂量组细胞损伤程度较高、中剂量组严重（见图1⑥）。

图1 蒲黄黄酮对缺氧损伤后HUVE-12形态影响图（×30）

2.2 蒲黄黄酮对缺氧损伤后HUVE-12的体外毒性影响

经MTT法检测，当蒲黄黄酮浓度为150μg/mL时，与正常组相比，细胞抑制率为1.7%，表明对细胞无毒性作用，可用于后续试验。

2.3 蒲黄黄酮对缺氧损伤HUVE-12细胞活性及NO、ET-1含量的影响

MTT法可反应细胞存活的数目，缺氧可引起内皮细胞减少，与正常组比较差异有显著统计学意义（P＜0.01）；蒲黄黄酮能抑制缺氧引起的细胞数目减少,低剂量组与缺氧组比较，P＜0.05；缺氧可使细胞培养上清液中NO含量降低，与正常组比较差异有显著统计学意义（P<0.01），蒲黄黄酮可减少缺氧时内皮细胞NO的降低程度，低剂量组与缺氧组比较差异有统计学意义（P<0.05），且随药物浓度的增加抑制作用增强，高剂量组与缺氧组比较差异有显著统计学意义（P<0.01），且蒲黄黄酮各浓度组与阳性对照组比较差异无统计学意义，说明缺氧时HUVE-12细胞NO的含量与蒲黄黄酮的浓度有一定的依赖性。缺氧时内皮细胞上清液中ET-1的含量升高，与正常组比较差异有统计学意义（P<0.01）,蒲黄黄酮可抑制缺氧时ET-1的分泌，低剂量组与缺氧组比较差异有统计学意义（P<0.05），高剂量组与缺氧组比较差异有显著统计学意义（P<0.01），与阳性对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表1。

表1 蒲黄黄酮对缺氧损伤HUVE-12细胞抑制率、NO、ET-1含量的影响 （，n=5）

表1 蒲黄黄酮对缺氧损伤HUVE-12细胞抑制率、NO、ET-1含量的影响 （，n=5）

注：与正常组比较**P<0.01；与缺氧组比较△P<0.05，△△P<0.01。

组 别正常组缺氧组高剂量组中剂量组低剂量组阳性对照组（E2）药物剂量（μg/mL）— —150 100 50 10-8mol/L抑制率(%)0 51.100**42.000△△37.700 43.300△36.600△△NO 的浓度（μmol/L）86.363±8.350 34.454±4.446**63.636±4.251△△54.090±7.774 39.090±8.860△62.272±5.230△△ET-1的含量（pg/mL）12.930±2.150 95.880±12.167**47.020±11.647△△61.080±13.275 74.640±15.620△49.700±9.577△△

3 讨论

血管内皮细胞（VEC）是人体最大、最重要的一种内分泌器官，具有重要而广泛的生物功能，在创伤修复、血管生成、动脉粥样硬化等一系列生理病理过程中行使着重要的调节作用。研究表明，当严重感染、缺氧、中毒等时，VEC受损会引起内皮功能障碍[5]，本次实验中，MTT法检测结果显示缺氧可明显降低HUVE-12的细胞活性，蒲黄黄酮组和雌二醇组均能提高缺氧条件下血管内皮细胞的存活率，且随着蒲黄黄酮浓度的变化，细胞存活率也会发生相应的改变。研究证实MTT比色法检测蒲黄提取物(药物浓度100～10 mg/L)对人脐静脉内皮细胞具有明显的促增殖作用[6]，与本研究结果相一致。

NO和ET是两种主要的内皮源性血管活性因子，两者与血管内皮细胞的功能也密切相关。NO可扩张血管，调节血压，抑制血小板聚集，抗平滑肌细胞增殖，一氧化氮合酶是NO合成的唯一限速酶。ET-1是已知最强的缩血管和加压物质，血管内皮细胞主要通过调控ET-1和NO的平衡来调节血管的功能。研究表明，缺氧时血管内皮细胞中ET-1mRNA分泌增多[7]。大量临床研究亦证实缺血性心脏病患者血液中ET含量增加，造成细胞损害的原因是血浆ET升高可导致钙通道或磷脂酰肌醇系统的激活，使Ca2+内流增加,引起细胞内Ca2+超载，故血浆ET的含量可在一定程度上反映血管内皮细胞受损程度。离体细胞实验也表明，川芎内酯A能提高细胞培养液中NO、NOS的活性，减少细胞培养液中ET的活性，调节内皮细胞iNOSmRNA和ETmRNA的表达，减轻内皮细胞损伤，保护心肌的血管内皮细胞[8]。近期研究发现，17-β雌二醇的抗动脉粥样硬化作用可能与其促进内皮细胞合成和释放NO有关[9]。研究发现，17-β雌二醇可以保护缺氧对血管内皮细胞的损伤机制可能是通过减轻NO的下降程度，抑制ET-1的升高，或是直接抑制ET-1mRNA的表达，从而降低细胞的凋亡率实现的[10]。VEC中存在雌激素受体已得到证实[11]，在本次体外实验中，阳性对照雌二醇组中的NO含量较缺氧组多,ET-1含量较缺氧组明显降低，这与前面所提结论相一致。有学者在蒲黄对高脂黄酮血症所致内皮损伤的保护作用的研究中发现，蒲黄有提高NO的作用[12]。蒲黄黄酮高、中、低各剂量组亦出现相同情况，在蒲黄黄酮3个剂量组之间，高、中剂量组相对于低剂量组减轻NO降低，抑制ET-1升高的作用要强。而蒲黄黄酮的类雌激素效应在课题组前期研究已经证实，提示：蒲黄黄酮对血管内皮细胞同样具有保护作用，其作用可能是通过增加NO的浓度，经受体介导途径上调一氧化氮合成酶（eNOS）的基因表达，增加eNOS的合成及其活性，抑制了ET-1mRNA的基因表达，调节NO/ET的平衡，还可能与蒲黄黄酮抗氧化活性以及抗自由基活性，抑制细胞内Ca2+的负荷，阻断ET-1相关基因表达，最后发挥缺氧时对血管内皮细胞的保护作用，但其具体作用机制目前尚不十分清楚，有待进一步从分子、基因水平进行研究。

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（本文编辑 彭芝配）

Protective effect of Pollen Typhae flavone on anoxia-damaged vascular endothelial cells

LIN Jie,JIA Chun-yan,WANG Ruo-guang,WANG Xuan,XIAO Yan-juan Xiao,YE Zan
（First Affiliated Hospital,TCM University of Hunan，Changsha,Hunan 410007,China）

Objective To study the influences of anoxia on vascular endothelial cells(HUVE-12)activity,endothelin(ET)and nitrogen monoxidum(NO)contents.Methods The damage of vascular endothelial cells was induced by means of anoxia,the action of Pollen Typhae flavone on vascular endothelial cells was measured with MTT chromatometry,and the ET-1 and NO contents with enzyme-linked immunoassay.Results Pollen Typhaeflavone elevated cytoactive of anoxic HUVE-12,reduced NO lowering level（P<0.05） and inhibited ET-1 production（P<0.05）.Conclusion The protective effect of Pollen Typhae flavone exists a protective effect for anoxiadamaged vascular endothelial cells,which maybe related to the generation of NO and ET-1.

Pollen Typhae flavone;vascular endothelial cells;anoxic damage;protective effect

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2011.05.003.010.03

2011－02－27

湖南省自然科学基金资助项目（08JJ5030）。

林 洁（1964-），女，广东蕉岭人，主任医师，教授，硕士研究生导师，国家第四批名老中医学术继承人，主要从事中医、中西医结合妇产科学临床、科研及教学。