UFCI基因在乳腺细胞系中的表达分析

贺爱兰，张梦成，彭东海

(1.湖南人文科技学院生命科学系，湖南 娄底417001;2.湖南人文科技学院 计算机系，湖南娄底417001)

乳腺癌是一种严重威胁女性生命健康的恶性肿瘤之一，其患病率占女性恶性肿瘤的第一位。全世界每年约有新发女性乳腺癌患者120万，去年因乳腺癌死亡者约46.5万人。尽管对乳腺癌的治疗探索己有100多年的历史，迄今为止，乳腺癌的病因及其恶性进展的具体机制尚未完全阐明。与其他恶性肿瘤一样乳腺癌其形成与发展是多步骤渐进、多种因素综合作用的结果。肿瘤的浸润和转移是导致患者死亡的一个主要原因，浸润和转移是一个多基因参与、多步骤进行及多阶段发展的过程。随着分子生物学的快速发展，一种新的途径引起人们的关注，即:泛素 (ubiquitin)系统。随着人们对肿瘤发生的分子机制进一步的了解，泛素介导的蛋白质降解途径在肿瘤发生中的重要性也越来越显著，并且逐渐成为肿瘤治疗的主要靶点之一。

UFC1的全名为“ubiquitin－fold modifier conjugating enzyme 1”是一个新鉴定的类似泛素结合酶E2。Ufc1的功能是 Ufm1(ubiquitin－fold modifier 1)结合酶，其活性位点是Cys116。Ufm1(ubiquitin－fold modifier 1)是一种类泛素修饰因子，通过 Uba5(E1)和 Ufc1(E2)共价结合到靶蛋白上。目前，对UFC1的功能研究报道还比较少，有待更进一步的研究和探讨。UFC1在泛素系统中的作用越来越引起人们的重视，但对于UFC1在乳腺癌发生和发展中的作用机制的研究还未见报道。

1 材料与方法

1.1 材料

T4 DNA聚合酶和反转录试剂盒购自 TaKaRa，总 RNA提取的 TRIZOL 试剂购自 Invitrogen，，MCF7，HBL100，MDA－MB231，MDA－MB－453细胞系由实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

一系列的乳腺细胞(MCF7，HBL100，MDA －MB231，MDA－MB－453细胞系)在37℃、5%CO2、相对湿度95%细胞培养箱中培养，培养液为DMEM培养液(补加10%新生牛血清、2 mol/L谷氨酰胺和100 mg/L青霉素和100 mg/L链霉素).

1.2.2 总RNA的提取

当细胞长至90%，收集细胞，用PBS洗一次，800 rpm离心5 min，去上清;加入TRIZOL 1 mL，吹打混匀，置室温10 min;加氯仿 0.2 mL 振荡 15 s，置室温 5 min;4°C，10000 rpm离心10 min;仔细吸取上层水相，移至另一离心管，勿吸动中间蛋白相;加入0.5 mL异丙醇，颠倒混匀，－20°C放置2 h或过夜;4°C，10000 rpm离心10 min，弃上层液相;加冷冻75%乙醇(0.1%DEPC水配制)1 mL，充分洗涤沉淀，4°C，5000 rpm离心5 min;弃上清，置于空气中15－20 min，沉淀溶于0.1%DEPC水;将细胞中提取的RNA各取2 μL进行琼脂糖电泳检测。

1.2.3 半定量RT－ PCR 分析

分别取各细胞系中所提取的总 RNA 2μg，按Promega的反转录试剂盒说明书进行反转录20μL反应体系，合成cDNA。再以逆转录后的反应液2μL作为模板，对UFC1基因的表达进行半定量RT－PCR分析，PCR引物采用Primer Premier 5.0软件设计。引物序列如下:UFC1正义链:5'－ GATCGTGAGTTGTGGGTGCA －3'，反义链:5'－ TGTTGGATGACGCCCTTCTG －3'(413bp);β－actin正义链:5'－GCGCGGCTACAGCTTCA －3'，反义链:5'－ CTTAATGTCACGCACGAT TTCC －3'(68bp)。PCR条件:94℃变性3分钟;94℃1分钟，60℃30秒，72℃30秒，共30个循环;72℃延伸10分钟，4℃保存。1.2%琼脂糖电泳，用UVP凝胶成像系统拍照并使用图像分析软件(Image J)分析同一样本UFC1基因与β－actin PCR产物条带的吸光度，计算UFC1条带与β－actin条带吸光度比值〔UFC1 mRNA指数=UFC1吸光度值/β－actin吸光度值〕，对UFC1 mRNA表达水平进行半定量分析。

2 结果与分析

2.1 一系列的乳腺细胞系中的总RNA的提取

培养一系列的乳腺细胞(MCF7，HBL100，MDAMB231，MDA－MB－453细胞系)于10 cm皿中，当细胞长至90%，收集细胞，按照试剂说明书，用TRIZOL(Invitrogen，U.S.A.)提取RNA;将细胞中提取的RNA 各取2μL 进行琼脂糖电泳，可以观察到清晰的28 S、18 S、5 S条带(图1)，实验结果说明RNA的提取效果理想，然后检测各RNA的OD260/280值，其OD260/280值都在1.85左右，说明提取的RNA有着较高的浓度(图1).

图1 在一系列的乳腺细胞系中提取的RNA琼脂糖凝胶电泳图

2.2 UFC1在乳腺细胞系中的表达谱

用半定量RT－PCR的方法来检测UFC1在乳腺细胞系中的表达情况，电泳结果显示(图2)，各组内参β－actin条带亮度相似，UFC1基因在HBL100乳腺细胞系中的表达最高，而在乳腺癌细胞系MCF7，MDA－MB231，MDA－MB－453中的表达明显降低，并且在乳腺癌细胞MDA－MB－453中的表达量最低。UFC1 mRNA指数〔UFC1吸光度值/β－actin吸光度值〕在HBL100细胞系中为11.7，MDAMB－453细胞系中为0.1，MDA －MB231细胞系中为0.7，MCF7细胞系中为0.8。在实验过程中，目的基因UFC1和内参β－actin在琼脂糖电泳后都只有单一的一条带，说明两个基因都是特异性的扩增，实验没有污染。

图2 用半定量RT－PCR检测一系列的乳腺细胞系中UFC1 mRNA的表达

3 讨论

目前对蛋白质泛素化降解途径与肿瘤发生的关系方面的研究取得了长足的进步［1－2］，但是对于UFC1在泛素系统中的功能研究报道还比较少，有待更进一步的研究和探讨。UFC1在泛素系统中的作用越来越引起人们的重视［3－5］，但对于UFC1在乳腺癌组织中的表达情况及其相关性的研究还未见报道。

本实验以UFC1为研究对象，采用半定量RT－PCR检测方法，发现UFC1在一系列的乳腺细胞系中的表达不同(图2):在正常的HBL100乳腺细胞系中的表达最高，而在乳腺癌细胞系MCF7，MDA－MB231，MDA－MB－453中的表达明显降低。先前用real－time RT－PCR检测到UFC1在多数乳腺癌组织中低表达，而在正常的乳腺组织或者癌旁组织中，UFC1的相对表达量要高，同时也检测到 IFITM2，LY6E在多数乳腺癌组织中是高表达。IFITM2属于干扰素诱导的跨膜蛋白家族，编码一细胞表面蛋白，能够调节细胞粘连、影响细胞分化［6］。Andreu等人认为IFITM家族是人结肠癌的分子标志物［7］。他们还发现在IFITM mRNA水平上，乳腺癌与正常乳腺组织之间没有差异。但是其IFITM cDNA探针检测的是整个IFITM家族，所以并不能说明IFITM2在乳腺癌中没有异常表达。在我们的研究中，IFITM2和乳腺肿瘤是有一定关联的。Ly6e(RIG－E)跟细胞信号途径以及细胞粘连有关。它定位于小鼠第15号染色体(41.7cm)，在该区域发生遗传改变和淋巴瘤有关，原癌基因c－sis和c－myc也定位于该区域，不过在肝癌中其表达低于正常肝组织［8］。在乳腺癌细胞里，雌激素能够调节Ly6e的表达［9－10］，以往的研究还没有证据显示它和乳腺癌有直接的关系。

不同的乳腺细胞系和组织间的UFC1表达情况表明:UFC1的差异表达与乳腺癌之间有着相关性，为将UFC1作为新的靶分子引入肿瘤的临床预防和治疗提供实验依据。当然，还需要观察UFC1对乳腺癌细胞生长情况的影响，探讨UFC1在乳腺癌发生发展过程中的作用及可能的分子机制，我们也正在开展这方面的工作。这样，对于阐明人体乳腺癌的发生发展机制，为乳腺癌预防和治疗的研究提供一些有力的理论根据，这是降低乳腺癌高发病率和高死亡率的有效途径。

［1］CROSETTO N，BIENKO M，DIKIC I.Ubiquitin hubs in oncogenic networks［J］.Mol Cancer Res 2006，4(12):899 －904.

［2］HERSHKO A.Ubiquitin－mediated protein degradation［J］.J Biol Chem 1988，263(30):15237－15240.

［3］KOMATSU M，CHIBA T，TATSUMI K，etal.A novel protein －conjugating system for Ufm1，a ubiquitin － fold modifier［J］.Embo J 2004，23(9):1977－1986.

［4］LIU G，ARAMINI J，ATREYA H，etal.GFT NMR based resonance assignment for the 21 kDa human protein UFC1［J］.J Biomol NMR 2005，32(3):261.

［5］MIZUSHIMA T，TATSUMI K，OZAKI Y，etal.Crystal structure of Ufc1，the Ufm1 － conjugating enzyme［J］.Biochem Biophys Res Commun 2007，362(4):1079－1084.

［6］TANAKA S S，YAMAGUCHI Y L，TSOI B，etal.IFITM/Mil/fragilis family proteins IFITM1 and IFITM3 play distinct roles in mouse primordial germ cell homing and repulsion［J］.Dev Cell 2005，9(6):745－756.

［7］ANDREU P，COLNOT S，GODARD C，etal.Identification of the IFITM family as a new molecular marker in human colorectal tumors［J］.Cancer Res 2006，66(4):1949－1955.

［8］KONDOH N，WAKATSUKI T，RYO A，etal.Identification and characterization of genes associated with human hepatocellular carcinogenesis［J］.Cancer Res 1999，59(19):4990 － 4996.

［9］SOULEZ M，PARKER M G.Identification of novel oestrogen receptor target genes in human ZR75－1 breast cancer cells by expression profiling［J］.J Mol Endocrinol 2001，27(3):259 －274.

［10］BOURDEAU V，DESCHENES J，METIVIER R，etal.Genomewide identification of high－affinity estrogen response elements in human and mouse［J］.Mol Endocrinol 2004，18(6):1411－1427.