连翘挥发油的成分分析及抗病毒活性的考察

肖会敏，何 悦，王四旺，王剑波，谢艳华，缪 珊

第四军医大学药学系药物研究所，陕西西安 710032

连翘挥发油的成分分析及抗病毒活性的考察

肖会敏，何 悦，王四旺，王剑波，谢艳华，缪 珊

第四军医大学药学系药物研究所，陕西西安 710032

目的：考察连翘挥发油及其主要成分α-蒎烯及β-蒎烯对甲、乙型流感病毒与乙肝病毒的活性。方法：①通过GC-MS分析翘挥发油的化学成分；②以2.2.15细胞为乙型肝炎病毒载体，分别测定它们抑制乙型肝炎病毒进行DNA复制和产生HBsAg、HBeAg的能力；③以MDCK（狗肾）细胞为病毒宿主，分别测定它们抑制病毒引起细胞病变的程度（CPE）。结果：①在最大无毒剂量时，即在连翘挥发油 258.69μg/m l、α-蒎烯 258.69μg/ml、β-蒎烯 192.45μg/ml时，均无抗乙肝病毒活性；②连翘挥发油α-蒎烯、β-蒎烯的浓度分别是192.5μg/ml时，均无抗甲、乙型流感病毒活性；③连翘挥发油的主要成分是α-蒎烯及β-蒎烯，总相对含量为71.48%。结论：连翘挥发油、α-蒎烯及β-蒎烯均无抗甲、乙型流感病毒与乙肝病毒的活性。

连翘挥发油；α-蒎烯；β-蒎烯；流感病毒；乙肝病毒

连翘为木犀科植物连翘Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl的干燥果实，其中含有丰富的挥发油。在连翘心中含量在4%以上，平均可达3.8%[1]。其挥发油的主要成分是α-蒎烯、β-蒎烯等[2]。文献报道连翘用水蒸气蒸馏法提取的挥发油具有对流感病毒感染小鼠有保护作用。在鸡胚内能抑制流感病毒亚甲型、副流感仙台株的增殖[3]。β-蒎烯具有抑菌、抗感染、抗氧化作用等[4]，α-蒎烯具有抗真菌作用[5-6]。本文旨在分析连翘挥发油的成分，验证连翘挥发油的抗流感病毒活性，探讨其主要成分即α-蒎烯与β-蒎烯对流感病毒的活性，同时探讨它们对乙肝病毒的活性。

1 材料与仪器

1.1 试剂与试药

连翘挥发油，由我所采用水蒸气蒸馏法提取；α-蒎烯（99%）、β-蒎烯标准品（纯度为 99%），由 Sigma-Aldrich 公司提供；阳性对照药：拉米夫定（3TC），由葛兰素威康公司生产；乙肝病毒E抗原、S抗原酶联免疫检测试剂盒，北京北方生物技术研究所提供；3′-末端DNA探针同位素（α-32P-dCTP）聚合酶标记试剂盒，美国Perkin Elmer（PE）公司提供；2.2.15细胞，由国家新药筛选中心提供；病毒株：流感甲型病毒（济防90-15），流感乙型病毒（济防97-13），在鸡胚尿囊腔内培养传代（2008年11月），-80℃保存，由国家新药筛选中心提供；病毒唑（RBV），新乡药业有限公司（批号：20080301）。

1.2 仪器

岛津气质联用仪GCMS-QP2010 Plus，岛津公司。

表1 连翘挥发油化学成分分析

2 方法与结果

2.1 成分分析

2.1.1 色谱条件 RTX-1 MS色谱柱（30 m×0.25 mm），固定相厚度：0.25m，进样口温度：250℃；色谱程序升温条件为起始温度：40℃，保持 3min，升温速率：5℃/min，终点温度 250℃保持 5min；载气：氦气，流量：2ml/min，压力：28.8 kPa；分流比：100∶1，连接质谱结口温度 250℃，总流量：205 ml/min，进样量：1 μl（不含任何化学试剂）。

2.1.2 质谱条件 质量范围：m/z 20～400， 扫描间隔：0.50 s，扫描速度：833 D/s；检测电压：0.75 kV，电离电压：70 eV，E1电离源，离子源温度：200℃；获取的质谱数据用美国NIST08和WILEY7谱库检索。

2.2 抗乙型肝炎病毒活性实验

2.2.1 测试原理 以2.2.15细胞为乙型肝炎病毒载体，测定样品抑制乙型肝炎病毒进行DNA复制和产生HBsAg、HBeAg的能力。

2.2.2 样品处理 样品临用前溶于DMSO配成适当浓度，检测时用培养液作3倍稀释，共8个稀释度。

2.2.4 测试方法 2.2.15细胞种96孔培养板，36 h后按以上稀释度分别加入样品及阳性对照药，同时设细胞对照孔，加药96 h后分别更换含不同稀释浓度样品的培养液，于加药后第8天分别收集细胞上清液及2.2.15细胞，采用酶联免疫法检测细胞上清中HBsAg、HBeAg的分泌量，点杂交的方法检测细胞中HBV DNA复制程度，分别计算IC50及SI。

2.3 抗流感甲、乙型病毒实验

2.3.1 测试原理 以MDCK（狗肾）细胞为病毒宿主，测定样品抑制病毒引起细胞病变程度（CPE）。

2.3.2 样品处理 样品溶于DMSO，再用培养液配成适宜初始浓度，用培养液作3倍稀释，各8个稀释度。

2.3.3 测试方法 MDCK细胞接种96孔培养板，置5%CO2，37°C培养24 h。MDCK细胞分别加入流感甲型病毒10-4（316 倍 TCID50）、流感乙型病毒 10-3（316 倍 TCID50），37℃吸附2 h后倾去病毒液，分别加入不同稀释度药物。 设病毒对照和细胞对照，37°C培养40 h，观察结果，记录CPE，计算各样品抗流感病毒半数抑制浓度（IC50）。

2.4 结果

连翘挥发油化学成分分析结果显示其主要成分是α-蒎烯及β-蒎烯，总相对含量为71.48%，与文献报道基本一致[2]，见表 1。连翘挥发油、β-蒎烯与 α-蒎烯对 2.2.15细胞的HBsAg、HBeAg分泌均无抑制作用，对2.2.15细胞的HBV DNA复制均无抑制作用；阳性对照药3TC样品对2.2.15细胞的HBsAg、HBeAg分泌均无抑制作用，对2.2.15细胞的HBV DNA 复 制 有 显 著 抑制 作 用 ，IC50为 9.19 μg/ml；SI＞108.8，见表2；连翘挥发油、β-蒎烯与α-蒎烯对甲型流感病毒（济防90-15）与乙型流感病毒（济防97-13）均无抑制作用，见表 3。

表2 抗乙型肝炎病毒测试结果

注：-表示样品在最大无毒剂量无抗病毒活性；TC50表示对细胞半数有毒浓度；IC50表示对病毒半数抑制浓度；SI表示选择指数，SI=TC50/IC50

表3 抗流感甲、乙型病毒测试结果

3 讨论

连翘抗病毒提取物主要是用连翘的水提物、醇提物、挥发油等；主要成分是苯乙醇苷类、黄酮类及木脂素类；抗病毒实验主要是针对呼吸系统的病毒如合胞病毒（RSV）、腺病毒7（Ad7）、柯萨奇 B 组病毒 3 型（CB3）、流感病毒甲 3 亚型（Fa3）、副流感病毒Ⅲ型（PF3）、埃柯病毒等以及单纯疱疹病毒[1]。

实验结果显示，连翘挥发油及其主要成分即α-蒎烯与β-蒎烯没有抗流感病毒作用，这与文献报道不一致[3]。文献[3]未对连翘挥发油的成分进行分分析，但是文献[1]显示不同产地与不同提取方法所得挥发油主要成分基本一致即α-蒎烯与β-蒎烯，由于实验结果显示两个主要成分均无抗病毒作用，证明它们均无直接的抗流感病毒作用。因此，文献抗流感病毒的结果可能是连翘挥发油中的其他成分发挥的作用或者是连翘挥发油激活小鼠体内其他途径抑制流感病毒的作用。为此，在随后的研究中我们将进一步研究它们对流感病毒等病毒的作用。

[1]肖会敏,王四旺,王剑波,等.连翘挥发油的成分分析及其药理作用的研究进展[J].时珍国医国药,2008,19(8):2047-2048.

[2]孙杰,姚健,达文燕,等.连翘挥发油化学成分的研究[J].西北师范大学学报,2001,37:77-81.

[3]马振亚.连翘种子挥发油抗流感病毒等病原微生物作用的实验研究[J].陕西新医药,1980,9(11):51.

[4]肖会敏,王四旺,王剑波,等.连翘抗病毒的研究进展[J].中国医药导报,2010,7(2):9-10.

[5]夏忠弟,毛学政,罗映辉.α-蒎烯抗真菌机制的研究[J].湖南医科大学学报,1999,24(6):507.

[6]夏忠弟,余俊龙.α-蒎烯对白色念珠菌生物合成的影响[J].中国现代医学杂志,2000,10(1):44,46.

Com ponent analysis of forsythia essential oil and study on their anti-viral activity

XIAOHuimin,HEYue,WANGSiwang,WANGJianbo，XIEYanhua,MIAOShan
Institute of Materia Medical,School of Pharmacology,the Fourth Military Medical University,Xi′an 710032,China

Objective:To investigate the activity that inhibited influenza A and B virus and hepatovirus B(HBV)from Forsythia essential oil and itsmain components includingα-pinene andβ-pinene.Methods:①Using GC-MS to analyse the components of Forsythia essential oil.②Using 2.2.15 cells as HBV′s vector to determine the content of HBV DNA duplicated and HBsAg and HBeAg produced from them，respectively.③Using MDCK cells as host cells to observe the cytopathic effect(CPE)resulting from their inhabiting influenza A and B virus.Results：①Under themaximum nontoxic doses,itwas no inhibiting HBV′s activity that the concentration of Forsythia essential oilwas 258.69 μg/m l and the concentration ofα-pinene was 258.69 μg/ml and the concentration ofβ-pinene was 192.45 μg/ml.②Itwas no inhibiting influenza A and B viruses′activity that the concentration of Forsythia essential oil and α-pinene and β-pinene was 192.5 μg/ml,respectively.③Forsythia essential oil′s main components were α-pinene and β-pinene the amount of which was 71.48%.Conclusion:Forsythia essential oil and α-pinene and β-pinene were no inhibiting influenza A and B viruses and HBV′s activity.

Forsythia essential oil;α-pinene;β-pinene;Influenza virus;Hepatovirus B

R284.1

A

1673-7210（2011）03（b）-031-03

肖会敏（1975.12-），男，汉族，江西宁都人，硕士学历，主管药师，中药物效基础研究。

王四旺（1958.8-），男，汉族，湖北武汉人，硕士学历，博士生导师，中药物效基础研究。

2011-01-10）