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高效液相色谱法同时测定清浊祛毒丸中咖啡酸、虎杖苷、丹皮酚含量

2011-01-25张晓娟钟明利

中国药业 2011年10期
关键词:丹皮虎杖液相

黎 强,张晓娟,钟明利

(1.广西壮族自治区玉林食品药品检验所,广西 玉林 537000; 2.广西桂林医学院,广西 桂林 541004)

高效液相色谱法同时测定清浊祛毒丸中咖啡酸、虎杖苷、丹皮酚含量

黎 强1,张晓娟1,钟明利2

(1.广西壮族自治区玉林食品药品检验所,广西 玉林 537000; 2.广西桂林医学院,广西 桂林 541004)

目的建立同时测定清浊祛毒丸中咖啡酸、虎杖苷和丹皮酚含量的高效液相色谱法。方法采用Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),用甲醇 -0.1%磷酸流动相进行梯度洗脱,流速 1.0 mL/min,检测波长 314 nm,进样量 5 μL。结果咖啡酸、虎杖苷和丹皮酚质量浓度线性范围分别是 4.8 ~96.0 μg/mL(r=0.999 5, n=5),4.1 ~82.0 μg/mL(r=1.0, n=5)和 12.0 ~240.0 μg/mL(r=0.999 9,n=5),平均加样回收率分别为 101.10%(RSD=1.6% ,n=9),101.62%(RSD=0.8% ,n=9),102.71%(RSD=1.2% ,n=9)。结论该法方便、快捷、准确、灵敏、重现性好,能更全面地控制清浊祛毒丸的质量。

清浊祛毒丸;咖啡酸;虎杖苷;丹皮酚;高效液相色谱;含量

The linear ranges of caffeic acid,polydatin and paeonol were 4.8 - 96.0 μg/mL(r=0.999 5, n=5),4.1 - 82.0 μg/mL(r=1.0, n=5)and 12.0 - 240.0 μg/mL(r=0.999 9, n=5),respectively.The average recovery rates were 101.62% (RSD=0.8% , n=9)for polydatin,101.10% (RSD=1.6% , n=9)for caffeic acid and 102.71%(RSD=1.2% , n=9)for paeonol respectively.Conclusion The method is simple,rapid,accurate and sensitive with good reproducibility,which is suitable for fully controlling the quality of Qingzuoqudu Pills.Key words:Qingzhuoqudu pills;caffeic acid;polydatin;paeonol;HPLC;content determination

清浊祛毒丸由蒲公英、牡丹皮、虎杖、地黄、山茱萸等12味中药制成,能清热解毒、利湿祛暑,用于治疗湿热下注所致尿频、尿急、尿痛等。现行标准中其质量控制方法为用紫外分光光度法测定丹皮酚的含量[1],但该法操作较为烦琐。本试验用高效液相色谱(HPLC)法同时测定清浊祛毒丸的咖啡酸、虎杖苷和丹皮酚含量,能更全面地控制清浊祛毒丸的质量。

1 仪器与试药

1100 Series高效液相色谱仪(安捷伦);TU-1221型紫外-可见分光光度计(北京普析通用);AE240型电子分析天平(梅特勒-托利多);SB2200型超声清洗器(上海必能信超声有限公司)。对照品咖啡酸(批号为 885-200001),虎杖苷(批号为 111575-200301);丹皮酚(批号为0780-9704),均由中国药品生物制品检定所提供;甲醇、磷酸(色谱纯),一级纯化水;清浊祛毒丸(批号为081102,090701,090801,090504,广西玉林大清药业有限公司);大血藤、蒲公英、牡丹皮、虎杖、地黄、山茱萸等12味药材(市售品)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱为 AgilentEclipse XDB -C18柱 (250 mm ×4.6 mm,5 μm),以甲醇为流动相 A,0.1% 磷酸为流动相B,按表1进行梯度洗脱,流速为 1.0 mL/min,检测波长为314 nm,柱温40℃,进样量5 μL。在上述色谱条件下,3个组分峰与相邻色谱峰的分离度均大于1.5,理论塔板数按咖啡酸、虎杖

表1 梯度洗脱条件

2.2 溶液制备

取清浊祛毒丸10袋,研成粉末,取约2.0 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇20 mL,称定质量,超声处理45 min,放冷,用甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,残渣再加10 mL甲醇,称定质量,超声处理10 min,放冷,用甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,合并滤液,用0.45 μm微孔滤膜滤过,续滤液即为供试品溶液。另分别取咖啡酸、虎杖苷和丹皮酚对照品适量,精密称定,以甲醇为溶剂,制成质量浓度分别为 0.143 4,0.515 6和1.840 8 g/L的对照品贮备液以及质量浓度为咖啡酸4.11 mg/mL、虎杖苷4.8 mg/mL及丹皮酚1.2 mg/mL的混合对照品溶液。

2.3 方法学考察

阴性对照试验:取按处方制备的分别不含蒲公英、虎杖和牡丹皮原药材的样品,按供试品溶液制备方法制备溶液试验。结果在咖啡酸、虎杖苷及丹皮酚的对应峰位上未出现色谱峰,说明阴性对照品溶液对测定无干扰(见图1)。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察:分别精密吸取混合对照品贮备液(咖啡酸4.11 mg/mL、虎杖苷 4.8 mg/mL,丹皮酚 1.2 mg/mL)0.1,0.2,0.4,1.0,2.0 mL,置 10 mL 量瓶中,以甲醇稀释至刻度,摇匀,得系列质量浓度的对照品混合溶液,进样测定峰面积,以对照品质量浓度(X)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线回归方程见表2。

表2 线性关系考察结果

精密度试验:将混合对照品贮备液稀释10倍,重复进样5次测定。结果峰面积、咖啡酸、虎杖苷和丹皮酚峰面积的 RSD分别为 0.8% ,0.2%,0.3%(n=5)。

稳定性试验:取同一供试品溶液,在室温避光条件下,分别于0,2,4,8,12,24 h 时进样,考察保留时间及峰面积的一致性。测得样品中咖啡酸、虎杖苷和丹皮酚峰面积的 RSD分别为1.4%,1.5% ,1.6%(n=6)。

重复性试验:取同一批(批号为081102)清浊祛毒丸样品,平行制备6份供试品溶液,进样分析。结果咖啡酸、虎杖苷和丹皮酚含量的平均值分别为 0.167 9,0.847 3,2.209 0 mg/g,RSD 分别为2.2% ,1.7%,2.3%。

加样回收试验:分别取已知含量的样品(批号为081102)9份,每份约 1.0 g,精密称定,分别精密加入混合对照品溶液 1.0,1.5,2.0 mL,每一浓度制备3份,挥干溶剂后测定各成分的含量并计算回收率。咖啡酸、虎杖苷及丹皮酚的平均回收率为101.1%,101.6%,102.7%,RSD 分别为 1.6% ,0.8%,1.2%(n=9)。

2.4 样品含量测定

另取3批样品,依法制备供试品溶液,进样测定峰面积以外标法计算咖啡酸。虎杖苷及丹皮酚含量结果见表3。

表3 样品含量测定结果

3 讨论

虎杖苷又名白藜芦醇苷,具有抗癌、抗菌消炎、抗氧化等生物学作用[2],因其属于二苯乙烯类化合物,在光照条件下不稳定,容易向其异构体或衍生物转化,导致含量降低,故须避光操作[3]。

取适当浓度的咖啡酸、虎杖苷及丹皮酚对照品溶液,在波长200~400 nm范围内做吸收光谱扫描,结果咖啡酸在323和217 nm波长处有最大吸收,虎杖苷在307和217 nm波长处有最大吸收,丹皮酚在314,274,228和213 nm波长处有最大吸收。经比对,各成分在314 nm波长处吸收较好,故最后选择314 nm为测定波长。

在色谱条件筛选试验中,对流动相比例及酸度、梯度洗脱时间、柱温以及进样量做了考察,结果以本试验的色谱条件为最佳。

提取方法[4-6]选择时,样品中咖啡酸的含量较少,故需要加大取样量。考察了甲醇、50%甲醇、乙醇等溶剂,发现甲醇的提取效率最高。而提取方法以超声提取效果最好,并且二次超声提取效率最高。故确定提取方法为超声处理45 min,过滤后残渣再加10 mL甲醇超声处理10 min,合并滤液。

[1]WS-10279(ZD -0279)-2002,国家药品标准(试行)[S].

[2]刘树兴,程丽英.虎杖有效成分的开发现状及展望[J].食品科技,2005(2):96-98.

[3]马丽艳,刘彦雷,梁学军,等.贮藏条件对葡萄酒中白藜芦醇的影响[J].中外葡萄与葡萄酒,2005(6):9.

[4]曾秋华,刘文京,唐晓晖.高效液相色谱法测定蒲公英颗粒中咖啡酸含量[J].中国药业,2007,l6(3):26.

[5]周丹丹,赵云丽,张 艳,等.RP-HPLC法同时测定乙肝舒康胶囊中虎杖苷和二苯乙烯苷含量[J].药物分析杂志,2008,28(3):411.

[6]张翠英,李忠保,李振国,等.HPLC测定六昧地黄颗粒中马钱苷和丹皮酚含量[J].中成药,2008,30(12):1 791 -1 794.

Simultaneous Determination of Caffeic Acid,Polydatin and Paeonol in Qingzhuoqudu Pills by HPLC

Li Qiang1, Zhang Xiaojuan1, Zhong Mingli2
(1.Yulin Institute for Food and Drug Control, Yulin, Guangxi, China 537000; 2.Guilin Medical College, Guilin, Guangxi, China 541004)

ObjectiveTo establish a HPLC method for simultaneous determination of caffeic acid,polydatin and paeonol in Qingzhuoqudu Pills.Methods The Agilent Eclipse XDB - C18column(250 mm ×4.6 mm,5 μm)was used with the mobile phase of methanol-0.1%phosphoric acid.The flow rate was 1.0 mL/min and the UV detection wavelength was set at 314 nm.The sample size was 5 μL.Results

R284.1;R286.0

A

1006-4931(2011)10-0038-02

2010-03-12)

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