多发性乳腺纤维腺瘤患者免疫组化相关指标的研究

张秀侠 楼丽华 张 庆

1 浙江省杭州市余杭区第一人民医院普外二科 311000; 2 浙江省中医院乳腺病诊疗中心

多发性乳腺纤维腺瘤患者免疫组化相关指标的研究

张秀侠1楼丽华2张 庆1

1 浙江省杭州市余杭区第一人民医院普外二科 311000; 2 浙江省中医院乳腺病诊疗中心

目的：探讨多发性乳腺纤维腺瘤的病因和发病机理,研究免疫组化法检测的相关指标在本病发生过程中的意义。方法：用免疫组化法检测90例多发性乳腺纤维腺瘤患者和30例乳腺增生病患者乳腺组织中雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)、细胞增殖抗原标记物(K i-67)、抑癌基因P53及人类癌基因CerbB-2的表达。结果：(1)多发性乳腺纤维腺瘤患者PR的阳性表达率及高强度阳性表达率均高于对照组(前者P＜0.01,后者P＜0.05);K i-67的阳性表达率明显高于对照组(P＜0.05);(2)多发性乳腺纤维腺瘤患者ER、PR之间有显著相关性(P＜0.01);(3)多发性乳腺纤维腺瘤患者ER的阳性表达率与对照组相比无显著性差异(P＞0.05); (4)多发性乳腺纤维腺瘤患者ER、PR与K i-67的表达之间无相关性(P＞0.05);(5)P53和CerbB-2在本病中均无表达。结论：(1)局部乳腺组织中PR的阳性表达率及阳性表达强度升高也是乳腺纤维腺瘤发病的主要因素;(2)ER、PR间存在的相关性在本病的发生中起了主要作用;(3)Ki-67的阳性表达率升高,说明细胞增殖能力较强,这可能也是本病发生的直接原因。

多发性纤维腺瘤 乳腺肿瘤 免疫组织化学

乳腺纤维腺瘤(fibroadenoma of breast)又称乳腺纤维瘤,是由乳腺纤维组织和腺管两种成分增生共同构成的乳房良性肿瘤,其发病率在乳腺良性肿瘤中居首位。乳腺纤维腺瘤可发生于青春期后任何年龄的女性,但以20～25岁的年轻女性多见,绝经后妇女较少见。表现为扁圆或卵圆形的无痛性肿块,质实韧,活动度较好,肿块不随月经周期而变化。一般为单发肿物,约20%～25%为多发。

多发性乳腺纤维腺瘤是指同时或先后发生于乳房同侧或双侧的2个以上的纤维腺瘤。多发性乳腺纤维腺瘤患者在多次手术后,不但乳房内部结构(如乳导管、腺体等)受到破坏,乳房的外部形态也会受到影响,进而给患者的身心造成损害。并且,术后复发的病例恶变率相对升高;妊娠期由于体内雌、孕性激素的大量增加,也可刺激腺瘤迅速增长,甚至可能诱发肉瘤变。所以,了解多发性乳腺纤维腺瘤的发病原因及发病机理,进而制定正确的预防措施和治疗方法就显得相当重要。

现代医学认为乳腺纤维腺瘤的发病原因尚不明确,一般认为其发病主要与患者体内性激素水平及乳腺组织局部雌、孕激素受体的量或质的异常有关。目前,国内外对于乳腺纤维腺瘤多发性的原因及机制的研究尚鲜见于文献报道,本文主要从免疫组化法检测所得的相关激素受体及基因方面探讨多发性乳腺纤维腺瘤的发病机制,从而为进一步研究和治疗本病提供理论依据和实验基础。

1 材料与方法

1.1 一般资料 收集乳腺病住院患者120例。根据患者术后病理诊断结果,将收集的病例分为多发性乳腺纤维腺瘤组90例(其中,同时多发者63例,异时多发者27例;发于单侧乳房者25例,发于双侧乳房者65例),平均年龄(30.58±8.07)岁;乳腺增生组30例,平均年龄(40.07±7.00)岁。入选标准如下：(1)非妊娠期、非哺乳期、无肝病及内分泌失调疾病、月经基本正常、近期内未服用过避孕药或其他激素类药物。(2)术后经病理诊断为(多发性)乳腺纤维腺瘤、乳腺增生病。(3)有完整的临床资料。

1.2 免疫组织化学法检测 经病理诊断为(多发性)乳腺纤维腺瘤、乳腺增生病患者的手术标本,分别进行免疫组化指标ER、PR、Ki-67、P53、CerbB-2的检测。(1)实验试剂：1∶10多聚赖氨酸、ER单克隆抗体(鼠抗人)、PR单克隆抗体(鼠抗人)、Ki-67单克隆抗体(鼠抗人)、P53单克隆抗体(鼠抗人)、CerbB-2单克隆抗体(鼠抗人)、DAB试剂盒(购自北京中山生物技术有限公司)。(2)实验方法及步骤：①玻片处理：彻底清洗,烤干后1∶10多聚赖氨酸涂抹玻片,风干。②标本处理：将手术切除的标本浸于10%甲醛溶液中,取材后,石蜡包埋,蜡块标本做4μm的连续切片数张,捞片。③设立实验对照：阳性对照：以确诊的阳性标本作为阳性对照。阴性对照：用PBS替代一抗,其余染色同。④免疫组化：(两步法)检测。⑤结果判定：用Olym pus显微镜观察,高倍镜下计数4个随机视野,每个视野计数100个细胞,计算染色阳性的细胞占所计数细胞的百分比,按各视野计数的平均值结合染色强度作最后判定。ER、PR、Ki-67、P53阳性染色均位于胞核,或胞浆、胞核同时染色,以胞核染色为主,仅胞浆染色计为阴性,染色强度分为3级：1浅棕色;3深褐色;2介于1和 3之间。综合染色强度和表达率,ER、 PR、Ki-67、P53的判定标准为：(-)：完全阴性; (±)：阳性细胞比例＜10%;(+)：阳性细胞比例10%～25%;(++)：阳性细胞比例26%～50%; (+++)：阳性细胞比例51%～100%。二分法以10%为阈值确定阴性和阳性。CerbB-2阳性细胞为膜着色,不着色为阴性(-);着色阳性细胞数＞10%为阳性,其中着色弱且不连续为弱阳性(+),着色中等部分不连续为阳性(++),着色强且连续为强阳性(+++)。(3)实验设备：Leica全自动脱水机、BM-IV生物组织冷冻包埋机、Leica RM2135型全自动切片机、PHY-Ⅲ病理组织漂烘处理仪、Olympus U-B130多头光学显微镜及高压锅、恒温烤箱、10m l吸管、高精度加液器及吸头、染色缸、保湿孵育盒、擦拭纸、盖玻片、可调计时器等。

1.3 统计学处理 采用SPSS11.5统计软件进行统计学分析。数据资料用±s(均数±标准差)表示,两组间数据比较用t检验,计量资料用χ2检验。检验以P＜0.05或P＜0.01为差异显著的标准。

2 免疫组织化学法检测结果

2.1 两组间ER、PR、Ki-67阳性表达率比较 两组患者免疫组化检测,P53、CerbB-2均为阴性,无1例表达,统计学比较无显著差异。ER、PR、Ki-67结果的比较和统计见表1及图1。

表1 多发性乳腺纤维腺瘤组与乳腺增生组ER、PR、Ki-67的阳性表达率比较

图1 多发性乳腺纤维腺瘤与乳腺增生患者ER、PE、K i-67阳性率对比

由表1、图1可见：多发性乳腺纤维腺瘤患者与增生组相比,雌、孕激素受体及Ki-67的阳性表达率均高于增生组。PR有非常显著差异(P＜0.01), Ki-67有显著差异(P＜0.05),ER无统计学差异。

2.2 两组间ER、PR、Ki-67的阳性表达强度 多发性乳腺纤维腺瘤患者ER、Ki-67的阳性强度主要表现在(+),与增生组一致;而PR的阳性强度主要表现在(++),与增生组相比有显著差异(P＜0.05)。 见表2、图2、图3。

表2 ER、PR、Ki-67的阳性表达强度比较

图2 多发性纤维腺瘤患者ER、PR、K i-67阳性表达图

图3 乳腺增生病患者ER、PR、K i-67阳性表达图

2.3 两组ER、PR、Ki-67的高阳性强度(++～+ ++)表达率比较 多发性乳腺纤维腺瘤患者ER、PR、Ki-67高强度阳性表达率与增生组相比,均高于增生组。其中PR的阳性高表达率比较有显著差异(P＜0.05),两组间ER及Ki-67的比较均无统计学差异。见表3、图4。

表3 ER、PR、K i-67的高阳性强度(++～+++)表达率比较

图4 多发性乳腺纤维腺瘤与乳腺增生患者ER、PR、K i-67阳性高表达率对比

2.4 ER、PR、Ki-67相关性 多发性乳腺纤维腺瘤患者ER、PR的表达有非常显著相关性(P＜0.01)。多发性乳腺纤维腺瘤患者 ER、PR的表达与K i-67的表达之间无相关性(P＞0.05)见表4、5。

3 分析与讨论

表4 多发性乳腺纤维腺瘤患者ER、PR的相关性(n=90)

表5 多发性乳腺纤维腺瘤患者ER、PR与Ki-67的相关性(n=90)

3.1 现代医学对乳腺纤维腺瘤发病机理的认识现代医学认为乳腺纤维腺瘤的发病原因尚不明确,大多数学者认为乳腺纤维腺瘤的发病原因主要与雌、孕激素分泌平衡失调,雌激素绝对或相对升高,而孕激素绝对或相对降低,致使孕激素不能制约雌激素对乳腺组织的过度刺激,以及乳腺局部组织对激素作用过度敏感有关。但有关乳腺纤维腺瘤存在多发性的原因尚未有见于文献报道。

3.2 多发性乳腺纤维腺瘤患者免疫组织化学相关指标分析 本病与乳腺增生病同属于乳腺组织的增生类疾病,乳腺增生病又称乳腺结构不良,是乳腺主质和间质不同程度地增生与复旧不全所致的乳腺结构在数量和形态上的异常。本病由乳腺纤维组织和腺管的过度增生所致,乳腺增生病是由乳腺主质和间质的弥漫性增生引起。故本研究在进行免疫组化检测过程中,把乳腺增生组与多发性乳腺纤维腺瘤组进行对照观察,旨在发现多发性乳腺纤维腺瘤患者乳腺局部组织中免疫组化相关指标的特殊表达。

免疫组织化学又称免疫细胞化学,是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应,对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来,借助显微镜的显像和放大作用,在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。

性激素作用是通过与其受体结合而产生的,雌、孕激素只有通过与其靶细胞内的ER、PR相结合,才能发挥其对乳腺组织的生物学效应,同时,乳腺局部实质成分性激素受体质和量的异常,可导致这些部位对激素的反应异常,局部刺激过度,则可引起纤维腺瘤的发生。所以,检测ER、PR的阳性表达率及表达强度对探讨本病的发病原因有着十分重要的意义。

本研究显示,多发性乳腺纤维腺瘤患者ER阳性表达率及其高强度阳性表达率与增生组相比均无明显统计学意义(P＞0.05);PR阳性表达率93.33%,明显高于增生组的66.67%,有非常显著差异(P＜0.01);PR的高强度阳性表达率为62.22%,也显著高于增生组的26.67%,有非常显著差异(P＜0.01),多发性乳腺纤维腺瘤患者的阳性强度表现在(++),说明PR在多发性乳腺纤维腺瘤患者乳腺组织中的表达有着重要的意义。同时,研究显示：多发性乳腺纤维腺瘤患者ER、PR同时阳性表达的有68例,所占百分比为75.56%,统计结果还表明, ER和PR之间有直线相关性。有研究认为,PR是由雌激素诱导合成的,PR的表达说明细胞内ER的作用机制是完整的,其ER为功能性ER,PR的存在依赖于ER[1,2]。基于此,本研究证实：多发性乳腺纤维腺瘤患者的ER绝大多数为功能性ER,与临床研究结果[3]一致。Ki-67是在增殖细胞中表达的一种核抗原,存在于细胞周期中除G0期以外的所有阶段,与细胞的合成代谢有关,也是目前较为肯定的核增殖标志物[4]。故观察该指标在乳腺纤维腺瘤中的表达对于探讨本病的发病机制有着重要的意义。本研究发现,多发性乳腺纤维腺瘤患者Ki-67阳性表达的有31例,占研究总人数的34.44%,与增生组相比有显著差异(P＜0.05),由此可见,多发性乳腺纤维腺瘤患者细胞增殖能力较强,这也正是本病多发性的一个直接而主要的原因。本实验统计显示Ki-67阳性表达强度与增生组比较无统计学差异(P＞0.05)。有研究表明乳癌患者Ki-67的阳性表达与ER、PR阳性表达之间无显著相关性[4]。在本研究中,K i-67的表达与ER、PR之间也没有相关性。以上结果证明,患者的细胞增殖状态不受乳腺局部组织性激素受体量的影响,与受体表达无关。P53位于17号染色体短臂上,野生型P53基因抑制细胞转化,并能抑制癌基因的活动,而突变型P53基因可引起细胞的转化和癌变,使细胞无限增生[5]。野生型P53的蛋白量很低,半衰期短,只有20～30m in,而突变型P53的半衰期可达1.4～8h,在细胞内存积稳定,故用免疫组化方法在组织内实际检测到的P53均为突变型P53[6]。CerbB-2是一种细胞来源的癌基因,正常情况下处于非激活状态(又称原癌基因),参与细胞生长、分化的调节,当受到体内外某些因素作用而被激活时,具有肿瘤转化活性[4]。由于本病多发性的存在,导致其恶变率相对升高,故对多发性乳腺纤维腺瘤患者病变组织中P53及CerbB-2的检测也有重要意义。本研究也对P53和CerbB-2进行了检测与观察,旨在探讨其在多发性乳腺纤维腺瘤患者中有无特殊表达和意义,结果显示均为阴性,无1例表达,说明多发性乳腺纤维腺瘤患者细胞增殖能力虽然较强,但细胞分化无异常,细胞增生有度。

4 结论

本文应用现代研究方法从免疫组化方面研究了90例多发性乳腺纤维腺瘤患者病变组织ER、PR、Ki-67、P53及CerbB-2的表达情况。结果显示,多发性乳腺纤维腺瘤患者ER、PR的表达之间存在直线相关性,且两者均为阳性的比例也高于增生组,说明本病的发生与雌、孕激素分别与其受体相结合而共同发挥其生物学效应有关;多发性乳腺纤维腺瘤患者局部乳腺组织 Ki-67阳性表达率明显高于增生组,说明本病患者细胞增殖能力较强,这也是纤维腺瘤多发的一个直接而主要的原因。多发性乳腺纤维腺瘤患者ER、PR与Ki-67之间无相关性,说明本病患者细胞增殖活性与性激素受体的表达无关。P53、CerbB-2在多发性乳腺纤维腺瘤患者病变组织中的表现均为阴性,说明多发性乳腺纤维腺瘤患者细胞增殖能力虽然较高,但细胞分化尚无异常。

[1] Lyk kesfeldt AE,Braind P.Indirect mechanism of oestradiol stim ulation of cellp roliferation of human b reast cancer cell line〔J〕.Br JCancer,1986,53(1)：29-35.

[2] 曾庆富.乳腺癌组织中雌激素受体、孕激素受体和葡萄糖-6-磷酸脱氧酶相关性的研究〔J〕.中华病理学杂志,1991,20：107.

[3] 陈志秋,李秀平,李东,等.乳腺纤维腺瘤中雌、孕激素受体的表达〔J〕.临床与实践病理学杂志,2002,18(6)：666.

[4] 李宝江,等.K i-67、P53、VEGF和Cerb B-2在乳腺癌组织中表达的相关性研究及其临床意义〔J〕.癌症,2004,23(10)：1178.

[5] Norberg T,K laar S,Karf G,eta l.Increased p53 m utation frequency during tumor p rog ression-results from a b reast can cer cohort〔J〕.Cancer Res,2001,61(22)：8317-8321.

[6] 马鸿达,张乃鑫,仇晓菲,等.P53和CerbB-2癌基因产物在乳腺导管上皮增生病变中的表达〔J〕.天津医药,1996,24(8)：467.

The Study on the Relative Immunohistochem ical Index in the Patientwith Multip le Fibroadenoma of Breast

ZHANGXiuxia＊,LOU Lihua,ZHANGQing.＊DepartmentofGenaralSurgery,theYuhangDistrictFirstPeople's HospitalofHangzhouCity,ZhejiangProvince311000

Objective：To exam ine the pathogenesis o fmu ltiple fibroadenoma of breast and discuss the significance of immunohistochem ical indicatrix in the process of the disease.Methods：The expression of estrogen receptor(ER),progesterone recep tor(PR),the cell p ro liferating antigen Ki-67,anti-oncogene P53 and human oncogene CerbB-2 were tested by the immunohistochem ical assay in 90 cases withmu ltiple fibroadenomao f breastand 30 cases withmammary hyperp lasia.Results：(1)The positive rate and the pow erful positive rate of PR expression were both higher than that in healthy control group significantly(respective lyP＜0.01,P＜0.05).(2)There was significant dependability between ER and PR in the cases withmu ltip le fibroadenoma of breast(P＜0.01).(3)There was no significant dependability for the positive rate of ER expression betw een the caseswith multiple fibroadenoma of breast and the controlgroup(P＞0.05).(4)There was no significant dependab lity between the exp ression of ER and PR and the exp ression of K i-67(P＞0.05).(5)There was no expression of P53 and CerbB-2 in the cases with multip le fibroadenoma of breast.Conclusion：(1)The increase of the positive rate and the pow erfu l positive rate of PR exp ression in mammary g land partly is themajor factor for themu ltip le fibroadenoma of breast.(2)The dependability betw een ER and PR make an im portant role in the disease.(3)The increaseof the positive rate of Ki-67 expression prove that the cells'reproductiveactivity is strong,and perhaps this is the immediate cause which induce the disease.

Multip le fibroadenoma,Breast tumor,Immunohistochem ical

R737.9

A

1001-7585(2011)10-1117-04

2011-03-25

(编辑江山)

论 著