右归丸对自然衰老大鼠海马5-HT、NE含量与HPA轴活性作用的实验研究*

姚建平，金国琴，戴薇薇，姚龄爱，康湘萍

本研究通过观察自然衰老肾虚大鼠海马组织五羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)含量与HPA轴活性变化及右归丸对其的影响，探索衰老时海马组织5-HT、NE含量与HPA轴功能变化的关系。

1 材料

1.1 动物

雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，清洁级，上海中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号2003-0002。

1.2 主要试剂与药品

乙腈(acetonitrile)，HPLC 级，批号 020210，上海吴泾化工总厂;氯乙酸(Chloroacetic acid)，分析纯，批 号 017013/1 23903419，Fluka公 司;甲 醇(Methanol)，HPLC 级，批号 3246A，Sigma-Aldrich Laborchemikallen GmbH;去甲肾上腺素(NE)，优级纯，批号023K0697，Sigma公司;樟脑磺酸(C210–7(1s)-(+)-10camphorsulfonic acid)，分析纯，批号S11/93-024，Fluka公司;乙二胺四乙酸，分析纯，批号 015783/120103039，Fluka 公 司;5-羟 色 胺 (5-HT)，优级纯，批号 112K7002，Sigma公司;大鼠皮质酮放免检测试剂盒(Diagnostic Systems Laboratories，Inc)和中药(饮片)。

1.3 主要仪器

BAS高效液相色谱仪(Bio Analytical Systems，Inc)，BAS LC-4C电化学探测器(Bio Analytical Systems，Inc)，VELOSEP RP-18 层析柱(填料直径为3μm，规格为3.2×100mm，Perkin Elmer Company)，γ-射线计数仪(Beckman Company)。

2 方法

2.1 分组、造模与给药

SD雄性大鼠随机分为老年对照组、右归丸组，另设青年对照组共3组，温度18℃ ～22℃，光暗周期 12h∶12h，群养，5只/笼，常规喂养饲料，自由饮水。以自然衰老SD雄性大鼠(24月龄)为模型，老年对照组大鼠常规喂养至24月龄。右归丸组大鼠从20月龄始，按生药7.5g·kg－1(相当成人临床用量的15倍)自由饮用稀释药液，每周停药2d，连续4个月。

2.2 药材及制剂

右归丸组方及用量均参照《方剂学》第1版教材。原方用量:熟地24g，山药12g，山茱萸9g，枸杞子 9g，菟丝子 12g，鹿角胶 12g，炒杜仲 12g，当归 9g，肉桂6g，炮附子6g。中药(饮片)一次性购于上海华宇药业有限公司，按原方用量比例水煎浓缩成膏，－30℃保存。

2.3 取材

大鼠腹腔麻醉(25%乌拉坦，0.75mg/kg)，腹主动脉取血 5ml，制备血清(静置 1h 后，3000r·min－1，离心15min);用消毒手术器械取大鼠海马，置于高压蒸气灭菌的Eppendorf管中，－70℃保存。

2.4 HPLC-ED检测大鼠海马组织5-HT及NE含量［1、2］

2.4.1 样品处理 称取样品100mg，加入1ml 0.1M HCLO4，冰浴匀浆，组织匀浆液转入 1.5ml Eppendorf离心管中，低温离心(4℃，14000rpm，15min)后，将上清转入 Eppendorf离心管中，再次低温离心(4℃，14000rpm，15min)得样品溶液。

2.4.2 色谱条件 柱温35℃，电化学工作电压 750mV，流速为 0.3ml/min，进样量 5μl/次，流动相(0.15mM氯乙酸-氢氧化纳，EDTA 0.8mM和 D-樟脑-磺酸9mM，10%甲醇，pH 4.2)。

2.4.3 操作步骤 开机后调整好各参数，预热1h以200ml 40%乙腈冲洗色谱柱(使用前超声脱气)，再以流动相平衡色谱系统(使用前超声脱气)，进混合标准液，继续用流动相洗脱，待出峰稳定后加样品液，流动相洗脱至样品出峰。样品间隔用去离子水(18MΩ)冲洗。

2.4.4 定量方法 配制 50 ng/ml、100ng/ml、200ng/ml浓度的去甲肾上腺素(NE)、5-羟色胺(5-HT)标准液以及各标准品相应浓度的混合标准液。取5μl进行色谱分析，每个浓度的标准液进样5次，根据峰面积平均值作出标准品浓度校正线。样品峰面积根据校正线得出浓度值。

2.5 放免法检测血中皮质酮

按试剂盒说明操作，γ-射线计数仪检测 cpm(管/1min)。

2.6 数据及结果分析

所得数据均采用珋x±s表示，SPSS10.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)。

3 结果

3.1 右归丸对自然衰老大鼠海马组织5-HT和NE含量的影响

表1显示，与青年对照组比较，老年对照组大鼠海马5-HT含量显著升高，NE含量显著降低(P<0.05);与老年对照组比较，右归丸组大鼠海马5-HT含量显著下降，NE含量显著升高(P<0.05)。

表1 大鼠海马5-HT、NE含量(珋x±s，n=8)

3.2 右归丸对自然衰老大鼠血清皮质酮(CORT)含量的影响

表2显示，与青年对照组比较，老年对照组大鼠血清CORT含量显著增高(P<0.05);与老年对照组比较，右归丸组大鼠血清CORT含量显著下降(P<0.05)。

表2 大鼠血清CORT含量(珋x±s，n=10)

3 讨论

5-HT是一种分布广泛的生物性吲哚胺，由吲哚和乙胺两部分组成，约1% ～2%存在于CNS中。由于血脑屏障的存在，血液中的5-HT很难进入CNS，因此CNS和外周神经的5-HT分属2个独立的系统［3］。NE属儿茶酚胺类神经递质，体内有三类细胞能合成NE，即去甲肾上腺素能神经元、肾上腺素能神经元以及肾上腺髓质的嗜铬细胞，前两者作为神经递质，而后者则作为激素发挥作用。单胺类神经递质调节HPA轴的作用虽然至今仍有争议，但大量研究表明，NE在调节 HPA轴中主要起抑制作用［4］，5-HT 可促进 HPA 轴的活性［5］，并可通过下丘脑CRH促进 ACTH的分泌［3］，且5-HT与 NE在促进CRH释放方面呈相互拮抗作用［6］。体外实验也发现，5-HT可以增高培养的下丘脑细胞CRH的含量及释放，而 NE可降低 CRH的释放［7］。5-HT和NE通过对CRH释放的协调作用，参与对HPA轴的调控。

关于老年机体脑内5-HT及NE含量变化，研究报道，衰老过程中脑内 NE含量有下降趋势［8］，5-HT含量逐渐升高［9］。也有研究提出，衰老过程中5-HT浓度随增龄变化不大，而NE浓度下降［10］。但多数研究结果表明，衰老时5-HT/NE比值升高，提示衰老过程中脑内单胺类递质平衡被打破。联系5-HT对HPA轴的促进作用和NE对HPA轴的抑制作用，推测这两类神经递质的平衡对于维持HPA轴的稳态调节具有重要作用。

肾虚是重要的衰老理论之一，中医的“肾”与神经内分泌尤其与HPA轴之间存在密切联系。正常情况下中枢内的神经递质分泌保持在一定水平，以维持HPA轴的稳定功能。随着机体的老化，神经递质分泌与释放也相应发生增龄性改变，进而诱发HPA轴功能的紊乱。本实验结果显示，衰老大鼠海马组织5-HT含量的升高和NE含量的下降与HPA轴活性增强密切相关，补肾方药右归丸对海马组织NE含量的升高和对5-HT含量的降低作用可能是参与了HPA轴活性的调节。

［1］ Feldman S.The excitatory effects of the amygdala on hypothalamus-pituitary-adrenocortical responses are mediated by hypothalamic norepinephrine，serotonin，and CRH-4［J］.Brain Res Bull，1998，45(4):389-395.

［2］ Weidenfeld J，Newman ME，Itzik A，et al.The amygdala regulates the pituitary-adrenocortical response and release of hypothalamic serotonin following electrical stimulation of the dorsal raphe nucleus in the rat［J］.Neuroendocrinology，2002，76(2):63-74.

［3］ Bruley-Resset-M，Vergnon L.Interleukin-1 synthesis and activity in aged mice［J］.Mechanism of Aging and Development，1984，24(3):247-259.

［4］ 李电东.衰老过程中IL-2和IL-2R表达的变化［J］.实用老年医学，1997，11(抗衰老特集):1.

［5］ 宋淑霞，吕占军，侯洁，等.益气补肾方药对肾虚小鼠细胞因子IL-l、IL-2及 IL-l2基因表达的影响［J］.中国实验动物学报，2002，10(2):101-104.

［6］ 戴庆堂.白细胞介素-6与老年病［J］.中华老年医学杂志，1995，14(5):317-319.

［7］ Riancho JA，Zarrabeitia MT，Amado JA，et al.Age-related differences in cytokine secretion［J］.Gerontol，1994，40(3):8-19.

［8］ John CD， Buckingham JC. Cytokines:regulation of the hypothalamo-pituitary-adrenocortical axis［J］. Curr Opin Pharmacol，2003，3(1):78-91.

［9］ Dantzer R，Wollman E.Relationships between the brain and the immune system［J］.Soc Biol，2003，197(2):81-96.

［10］ Ferrari E，Fioravanti M，Magri F，et al.Variability of interactions between neuroendocrine and immunological functions in physiological aging and dementia of the Alzheimer′s type［J］.Ann N Y Acad Sci，2000，917.582-593.