白菜汁中3种酰胺类除草剂候选标准样品的制备与定值方法研究*

王建华 李 立 郭 翠

(1.山东出入境检验检疫局食品农产品检测中心，青岛 266002； 2.中国检验检疫科学研究院，北京 100025；3.济宁出入境检验检疫局, 济宁 272100)

我国是世界上农田杂草发生最严重的国家之一，据统计，每年因杂草危害给经济作物造成的损失约80亿元。近年来，中国农药工业发展十分迅速，农药品种成倍增长，而除草剂产业发展的增速远远高于杀虫剂和杀菌剂，目前产量已占农药总产量的1/3[1]。乙草胺、丁草胺、甲草胺均属于酰胺类除草剂，在我国普遍使用。近年来，日本在松茸和大粒花生中发现乙草胺检出超标。该类除草剂的作用机制是抑制杂草细胞内蛋白质的合成[2]，对动物和人的急性毒性较小[3]，但近年来却发现乙草胺、丁草胺具有弱的基因毒性[4]，使得酰胺类除草剂的残留检测问题备受关注。

山东检验检疫局技术中心作为能力验证提供者，开展了3种酰胺类除草剂测定的候选标准样品研制(以下称标准样品)，经过实验室间验证后，将形成标准物质，这对于新建立检测方法的确证、日常检测工作的质量保证和质量控制具有重要意义。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

气相色谱-质谱仪:7890-5975C型，配自动进样器，分流/不分流进样口，美国Agilent公司；

具塞塑料离心管：50 mL；

冷冻离心机：5810型， 德国Eppendorf 公司；

旋涡混合器、数显型水平振荡器：德国IKA公司；

旋转蒸发仪：R-215型，瑞士Buchi公司；

移液器：0.2、1.0、5 mL，法国Gilson公司；

乙草胺、丁草胺、甲草胺、异丙甲草胺除草剂纯标准物质：均购自美国Sigma公司；

乙腈、丙酮、正己烷:色谱纯,美国Burdick & Jackson公司。

1.2 标准样品的制备

称取商品化浓缩白菜汁5 kg，通过计算需添加浓度为25 mg/L的3种除草剂混标溶液约30 mL，使得制成的标准样品中除草剂含量约为150 μg/kg。由于浓缩白菜汁较粘稠，加标准溶液时应不断搅拌，并分多次添加。用磁力搅拌器搅拌约96 h，经测定上、中、下层样品除草剂含量值基本一致后，分装于50 mL塑料离心管，每瓶约40 mL共100瓶。

1.3 除草剂含量的测定

(1)测定方法

参考笔者已经验证的检测方法[5，6]：称取1.2中制备的白菜汁标准样品2.00 g于50 mL离心管，加入10 mL水、5 mL磷酸盐缓冲溶液、20 mL乙腈、约2 g氯化钠，水平振荡10 min，4℃下以5 000 r/min离心10 min，取上清液10 mL于梨形瓶，旋转蒸发至近1 mL。用SAX/PSA固相萃取柱净化[提前用5 mL丙酮-正己烷(体积比3∶7，下同)混和溶剂活化]，然后用20 mL丙酮-正己烷混和溶剂洗脱，浓缩后用丙酮-正己烷混和溶剂定容至1 mL，待GC-MS-SIM分析测定。

(2)GC-MS测定条件

色谱柱：HP-5 MS柱(30 m×0.25 mm, 0.25 μm)；载气：氦气；恒压模式136 kPa；柱温程序：初始温度70℃，保持4.0 min，以25 ℃/min升至150℃，以3℃/min升至200℃，再以8℃/min升至280℃，

保持10.0 min；离子源温度：150℃；四极杆温度：230℃；色谱-质谱接口温度：280℃；EI源电子能量：70 eV；SIM测定。

2 均匀性与稳定性检验

2.1 均匀性检验

将分装的100瓶样品随机分为10组，每组10瓶，每组任取1瓶平行2份进行测定，测定结果采用单因子方差统计分析[7]进行均匀性检验，即抽取i个样品(i=1、2、……m)，每个样在重复条件下测试j次(j=1、2、……n)。计算样品间平方和、样品内平方和以及自由度，从而计算统计量F。若F小于自由度为(f1，f2)及给定显著性水平α(选取α=0.05)的临界值F(f1，f2)，则表明样品内和样品间无显著性差异，样品是均匀的。

2.2 稳定性检验

将分装样品放于-18℃冷冻保存，按照先密后疏的间隔原则在180天内进行测定，分别在第10、20、60、90、180天随机取样，平行2份测定，根据测定结果进行冷冻条件下样品的稳定性检验。

由于没有合适的物理/化学模型来真实地描述该标准样品中除草剂的降解机理，故采用直线作为经验模型[7]。若该条件下白菜汁中除草剂含量稳定，则希望该模型中的截距等于测定值，而斜率趋近于零。

3 结果与讨论

3.1 检测方法的适用性验证

选用合适的测定方法是标准样品研制和定值的基础，实验采用的方法参考文献[5，6]，并同时通过实验方法的回收率和重复性来验证测定方法的可靠性，回收率数据可用于制样过程引入的不确定度分量的计算。用未添加除草剂的白菜汁作空白，添加水平为200 μg/kg，重复6次进行试验，结果见表1。该方法满足农药残留检测要求。

表1 添加回收试验结果 %

3.2 均匀性检验结果

均匀性检验数据见表2。由表3中公式进行计算，f1=9，f2=10，样品内和样品间的平方和、均方及F值见表4。由表4结果可看出F值均小于临界值F0.05(9，10)=3.02，即样品的均匀性良好[7]。

表2 均匀性检验实验数据 μg/kg

表3 均匀性检验公式[7]

表4 均匀性检验结果

3.3 稳定性检验结果

5个时间点测得的除草剂含量的平均值见表5。

表5 稳定性检验数据 μg/kg

直线模型[8]可表示为：

Y=b0+b1X+ε

式中：b0、b1——回归系数；

ε——随机误差分量。

直线中点的标准偏差：

与斜率相关的不确定度：

查表得，自由度为n-2=4，P=0.95时，t因子等于2.8，比较︱b1︱与t0.95,n-2·s(b1)的大小，若前者小说明斜率不显著，计算结果见表6。由表6可知，3种除草剂的︱b1︱值均小于t0.95,n-2·s(b1)，表明4种除草剂在 -18℃冷冻条件下180天内无明显的降解趋势，未观测到不稳定性。

表6 稳定性检验结果

3.4 标准样品的定值及不确定度评定

根据文献[9，10]，标准样品的定值方法如下：将均匀性测定结果中除草剂的平均浓度作为该标准样品的浓度，并且对研制过程中引入的不确定度进行评定。标准样品研制过程中的不确定度包括实验方法引入的不确定度、样品均匀性引入的不确定度及样品稳定性引入的不确定度。由于实验已验证样品的均匀性和稳定性均良好，故这两部分引入的不确定度可忽略，仅考虑实验方法带来的不确定度，以乙草胺为例不确定度分量及来源列于表7。

合成相对标准不确定度按下式计算：

uc=wuc,rel=130×0.095 97=12.48 (μg/kg)

取包含因子k=2，则扩展不确定度为：

U=kuc=2×12.48=25.0 (μg/kg)

3种除草剂的定值结果及不确定度列于表8。

表7 标准样品定值结果的不确定度分量及来源

表8 标准样品的定值结果及不确定度 μg/kg

[1] 张为农．近期我国除草剂和杀菌剂市场概况[J]．中国农药，2009(7)：52-53.

[2] 郑和辉，叶常明．甲草胺和丁草胺等除草剂在多个介质环境中环境行为综述[J]．环境科学进展，1999,7(3)：1-10.

[3] 姚斌，徐建民，张超兰．除草剂丁草胺的环境行为综述[J]．生态环境， 2003，12(1)：66-70.

[4] Yakovleva J, Zherdev A V, Popova V A, et al. Production of antibodies and development of enzyme-linked immunosorbent assays for herbicide butachlor[J].Anal Chem Acta, 2003,491:1-13.

[5] 王建华，王艳丽，牟俊，等.两种离子源技术GC/MS法检测蔬菜中多类除草剂的残留量 [J]．分析实验室，2009(3)：1-5.

[6] 王建华,郭翠,赵亮,等. 气相色谱-负化学电离质谱测定蔬菜中啶虫丙醚的残留量[J].化学分析计量，2009(5)：45-47.

[7] CNAS-GL03 能力验证样品均匀性和稳定性评价指南[S].

[8] CNAS-GL04 标准物质/标准样品生产者能力认可准则[S].

[9] 昃向君，陈世山，刘心同，等．食品安全检测实验室测量不确定度的评定与应用[M]．青岛：中国海洋大学出版社，2007.

[10] GB/T 15000.3-2008/ISO Guide 35 标准样品工作导则(3)标准样品定值的一般原则和统计方法[S]．