水产品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物检测方法的探讨

罗瑞峰 罗小玲 马小宁

[农业部食品质量监督检验测试中心(石河子)，石河子 832000]

孔雀石绿(MG)和结晶紫(CV)是一种三苯甲烷类染料，极易溶于水，水溶液呈蓝绿色。自1993年起孔雀石绿和结晶紫开始作为驱虫剂、杀菌剂、防腐剂在水产养殖中出现，而后因为具有价格低廉、效果显著等优点，被广泛应用于预防与治疗各类水产动物的水霉病、烂鳃病以及寄生虫病等。但随着研究的深入，孔雀石绿和结晶紫潜在的致癌、致畸、致突变等毒副作用[1]受到人们关注，人食用了残留孔雀石绿和结晶紫的鱼会对人体健康造成巨大威胁。

近几年，人们对水产品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物的研究非常活跃，关于检测方法的报道文献就有上百篇，国标、行业标准有4个[2-5]，基本原理是用乙腈-缓冲盐混合液提取，再用二氯甲烷液-液萃取，固相提取小柱净化，上仪器测定。但这几种方法在实际操作时会出现一些困难，比如：(1)液-液萃取时乳化较为严重，无法分层；(2)二氯甲烷层具有忽上忽下的现象；(3)提取液浓缩时暴沸；(4)样品处理液有分层现象；(5)上机标准溶液的定容介质和分析物的灵敏度有关。笔者对几种检测方法的前处理进行了比较，总结了这几种标准检测方法的优缺点，对其中的前处理方法进行适当优化，建立了快速筛选方法，同时探讨了测定过程中应注意的一些问题。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱仪：Waters 2695型，配Waters 2475荧光检测仪，美国Waters公司；

超声波清洗器：美国Waters公司；

漩涡振荡器：XW-80A型，上海精科实业有限公司；

高速冷冻离心机：H2500R-2型，长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司；

旋转蒸发仪：R-210型，上海博讯实业有限公司；

孔雀石绿标准品：已知含量不小于97.0%，美国Sigma-Aldrich公司；

无色孔雀石绿(LMG)标准品：已知含量不小于99.0%，美国Sigma-Aldrich公司；

结晶紫标准品：已知含量不小于97.0%，美国Sigma-Aldrich公司；

无色结晶紫(LCV)标准品：已知含量不小于99.0%，美国Sigma-Aldrich公司；

乙腈：色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司；

乙酸铵：优级纯；

二氯甲烷、盐酸羟胺、对甲苯磺酸、冰乙酸、二甘醇：分析纯；

混合提取溶液配制：称取盐酸羟胺13.4 g、对甲苯磺酸0.84 g、乙酸铵2.6 g溶于500 mL蒸馏水中，用冰乙酸调节溶液pH值为4.5；

硼氢化钾溶液:0.2 moL/L,称取0.54 g硼氢化钾溶于烧杯中，定容于50 mL的容量瓶中；

试验用水为符合GB/T 6682-1992规定的一级水。

1.2 仪器工作条件

Symmetry shieldRP C18不锈钢色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.1 moL/L乙酸铵溶液(pH 4.5,体积比为80∶20)，经0.45 μm滤膜过滤；流动相流速：1.0 mL/min；柱温：40.0℃；进样体积：50 μL；激发波长：265 nm；发射波长：360 nm。按上述条件测定标准工作溶液，得标准谱图见图1。

1.3 实验方法

(1)样品提取

称取5 g样品(精确至0.01 g)于50.0 mL离心管内，加入混合提取液10 mL，使用涡漩搅拌器充分混匀，加20 mL乙腈，以10 000 r/min匀浆2 min，放入-18℃的冰箱中冷冻30 min，将离心管放入高速冷冻离心机，于-5℃，以18 000 r/min离心15 min。中间清液用虹吸管转移至250 mL的分液漏斗中。离心管中再次加入混合提取液10 mL、乙腈20 mL，重复上述操作，合并提取液，分液漏斗中加入10 mL硼氢化钾溶液，充分混匀，放置反应10 min。

图1 无色孔雀石绿及无色结晶紫标准溶液色谱图

(2)样品净化

在250 mL的分液漏斗中加入饱和氯化钠溶液30 mL，振荡后静置分层，取上层有机相于鸡心瓶，用30 mL乙腈重复提取一次盐溶液，合并有机层，于45℃旋转蒸至近干，用少量乙腈溶解备用。丙基磺酸萃取小柱安装在固相萃取装置上，用5 mL乙腈活化小柱后，把鸡心瓶中的溶液移到小柱上过滤，用5 mL乙腈洗涤鸡心瓶两次，把洗涤液依次通过小柱，吹丙基磺酸萃取小柱近干，用10 mL甲醇-乙酸乙酯-氨水(体积比为5∶4.5∶0.5)洗脱，收集在鸡心瓶中，加0.5 mL乙酸中和，于45℃旋转蒸至近干，用乙腈定容至1.0 mL，经0.45 μm滤膜过滤，上机。

(3)标准溶液的配制

称取适量的孔雀石绿和结晶紫标准品，精确至0.1 mg，用乙腈配制成100 μg/mL的标准储备液，于-18℃避光保存。用乙腈稀释标准溶液，配制成1 μg/mL的孔雀石绿标准中间溶液，于-18℃避光保存。上机时准确吸取一定量孔雀石绿标准中间溶液，各加入0.05 mL硼氢化钾溶液(0.2 moL/L)，用乙腈准确定容至5 mL，配制成标准溶液系列为0.2、0.5、2.5、5.0、10.0、20.0 μg/L。

2 结果与讨论

2.1 提取方法的改进

几种标准检测方法经常会出现二氯甲烷反提步骤的分层不稳问题，由于不同水产品机体中蛋白质、脂肪含量和结构不同，检测基质有较大差异，加入二氯甲烷进行反提的步骤常发生分层不明显、二氯甲烷层忽上忽下的现象，易误判造成所需要的二氯甲烷层被舍弃而导致实验失败。在GB/T 20361、GB/T 19857、SC 3021和SN/T 1479中都提到加入氧化铝，用来除去蛋白质和脂肪，实验表明，加入氧化铝对回收率有较大影响，几种标准方法在提取液浓缩时常见瓶中有白色泡沫产生且易暴沸冲出，鸡心瓶内壁有大量脂肪，有时会留有残液很难蒸干，暴沸的原因可能是提取液中含有一定量的蛋白质。为克服前处理时出现的这些困难，用冷冻和超高速离心的方法除去基质中的蛋白质和脂肪，实验效果理想。

2.2 净化方法的改进

本方法在分液漏斗中加入饱和氯化钠溶液，使溶液更容易分层，由于盐析作用，使极性弱的LMG和LCV更易转入有机相。研究还发现，如果溶液中有MG和CV，加入饱和氯化钠溶液提取会使MG和CV的回收率显著降低，可能是由于MG和CV极性较强，在水溶液中以离子形态存在，加入饱和氯化钠溶液，使溶液的离子强度增加，对MG和CV发生了离子化效应，使MG和CV更容易溶解在水溶液中。本方法洗脱时采用碱性甲醇+乙酸乙酯的混合液，研究显示，10 mL碱性甲醇+乙酸乙酯混合液能把分析物完全洗脱。按国标的洗脱方法对样品进行加标回收试验，回收率较低，根据不同厂家的PRS柱，洗脱液在5～10 mL时才能完全洗脱。

2.3 回收率影响因素

待分析物质对光、热和氧气较为敏感，容易发生去甲基化和氧化降解，尤其是LMG和LCV。样品提取时，加入还原剂盐酸羟胺有助于防止待测物的降解氧化,加入离子对试剂对甲苯磺酸，有利于MG、CV形成离子对，增加乙腈对这两种物质的提取效率。样液浓缩时，比较了45℃条件下 N2吹干和旋转蒸发浓缩待测组分的损失率。结果表明，采用N2直接吹干，各组分的损失率超过50%；旋转蒸发浓缩的损失小，回收率大于95%。

2.4 线性方程与检出限

用荧光检测器测定0.2～20 μg/L范围的无色孔雀石绿、无色结晶紫，以各组分的峰面积(y)对相应浓度(c,μg/L)绘制标准曲线，无色孔雀石绿的线性方程为y=2.015×107c-5.24×102，无色结晶紫的线性方程为y=3.872×107c-1.52×102,各组分的相关系数r≥0.998。

以样品空白的3倍噪声计算检出限(LOD)，10倍噪声计算定量限(LOQ)，得出无色孔雀石绿和无色结晶紫检出限为0.5 μg/kg，定量限为2.0 μg/kg。

2.5 回收率及精密度试验

通过阴性样品加标验证该方法的回收率及精密度，孔雀石绿、结晶紫总量(全部还原为无色孔雀石绿和无色结晶紫)的加标回收率为78.3%～100.9%,相对标准偏差为1.3%～7.1%。回收率和精密度基本能满足要求，试验结果见表1。

表1 回收率和精密度试验结果

3 结语

讨论了水产品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物标准检测方法的优缺点，提出了一套简单实用的前处理方法，对不同水产品的处理均达到预期的效果，有较好的适应性，是一种通用的快速检测方法。该法有利于大批量样品的测定，而且该方法灵敏度好、准确度高，精密度好，是值得推广的水产品中孔雀石绿、结晶紫的检测方法。

[1] 翟毓秀,张翠,宁劲松，等.水产品中的孔雀石绿残留及其研究概况[J].海洋水产研究，2007,28(1)：101-108.

[2] SC 3021-2004 无公害食品 水产品中孔雀石绿残留量的测定 液相色谱法[S].

[3] GB/T 20361-2006 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法[S].

[4] GB/T 19857-2005 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定[S].

[5] SN/T 1479-2004 进出口水产品中孔雀石绿残留量检验方法[S].