GDNF在先天性肺囊性腺瘤样畸形中的表达及其意义

周玲玲，王宗敏，赵志光，王利群

（1.温州医学院附属第二医院 病理科，浙江 温州 325027；2.西安市第四医院 病理科，陕西 西安710000）

先天性肺囊性腺瘤样畸形（congenital cysticadenomatoid malformation of lung，CCAM）是一种较少见但严重影响儿童肺组织发育的先天性肺组织畸形。CCAM的确切病因尚不完全清楚，目前国际国内对其临床和影像诊断的报道比较多，而对于其发病机制的研究鲜见报道。本研究通过观察CCAM组织中胶质细胞源性神经营养因子（Glial cell line derived neutrotrophic factor，GDNF）和细胞增殖指数（Ki-67）的表达，从临床病理学和分子生物学角度讨论其在CCAM病理诊断、病理分型及发生、发展过程中的作用及其相关机制。

1 材料和方法

1.1 材料 CCAM组标本为2000-2008年我院及浙江省儿童医院年龄≤15岁CCAM患者（CCAM组）手术切除标本的存档蜡块58例（CCAM I型35例，CCAM I I型15例，CCAM I I I型8例）。同时取同期我院因其他疾病尸检的儿童肺组织10例作为对照组1（CG1组），CCAM囊肿周围相对正常肺组织10例作为对照组2（CG2组）。切片均由主任医师复诊确认。

1.2 试剂 标本用10%中性甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋，切片厚度为4 μm。浓缩型兔抗GDNF多克隆抗体购自美国Santa Cruz生物技术公司；免疫组化EliVision法检测试剂盒和DAB显色剂购自福州迈新生物技术开发公司；GDNF原位杂交检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；Ready-touse PCR kit 购自BIO BASIC INC；GDNF mRNA的多相寡核昔酸探针序列为：①5’-CGGGC AGCGG GAAGG CGGAC GCGGT GTGGA-3’；②5’-GCATA TTTGA GTCAC TGCTC AGCGC GAAGG-3’；③5’-TTGGT TTCAT AGCCC AGACC CAAGT CAGTG-3’。 引物参照人的GDNF基因（GenBank收录号为L19063）用引物设计软件Primer Premier 5.0自行设计，序列为GDNF，扩增长度为453 bp，引物如下：上游引物：5’-CGC AGG GAG CCC AGG CTT AAC-3’，下游引物：5’-CAA ACC AGC GCG TGT CAC T-3’；β-actin：上游引物：5’-CGT GGACA TCCGCAAAGAC-3’，下游引物：5’-CATC TGCTGGAA GGTGGACAG-3’。GDNF引物及β-actin引物，由上海生物工程公司合成。

1.3 方法 免疫组化和原位杂交操作步骤参照说明书，用已知阳性片作为阳性对照，用PBS缓冲液液取代一抗和探针杂交液作为阴性对照。FFPET PCR提取GDNF DNA进行基因测序由基因公司完成。

1.4 结果判定 Ki-67阳性细胞以细胞核呈棕黄色或棕褐色者为准；GDNF和GDNF mRNA的阳性表达主要以细胞质呈棕黄色或棕褐色者为准，分析采用IPP软件计算平均吸光密度值。

1.5 统计学处理方法 采用SPSS13.0统计软件进行分析。本实验数据以±s表示。采用单因素方差分析（LSD-t检验和SNK-q检验）进行统计，若方差不齐，采用Dunnett’s检验方法进行比较。取ɑ＝0.05作为检验标准。

2 结果

2.1 GDNF在CCAM中的表达 见表1。GDNF和GDNF mRNA的阳性表达位于胞质，部分GDNF在CCAM中呈核（浆）表达。其在CCAM各亚型组中的表达均高于CG1和CG2组（P<0.01）。GDNF在CCAM组中，CCAM I组（见图1）明显高于CCAM I I、I I I组（P<0.01），CCAM I I组（见图2）高于CCAM I I I组（见图3）（P<0.01），而GDNF在CG1组中呈阴性表达（见图4）。

图1 GDNF蛋白在CCAM I型中呈强阳性表达（免疫组化，10×20）

图2 GDNF蛋白在CCAM I I型中呈阳性表达（免疫组化，10×10）

图3 GDNF蛋白在CCAM I I I型中呈弱阳性表达（免疫组化，10×10）

图4 GDNF蛋白在CG1中呈阴性表达（免疫组化，20×10）

表1 GDNF和GDNF mRNA平均吸光密度值在各组中的比较（±s）

表1 GDNF和GDNF mRNA平均吸光密度值在各组中的比较（±s）

与CG1组比：*P<0.01；与CG2组比：#P<0.01；与CCAM I组比：☆P<0.01；与CCAM I I组比：△P<0.01

组别CCAM I CCAM I I CCAM I I I CG1 CG2 n 35 15 8 10 10 GDNF蛋白1.10±0.17*#0.81±0.22*#☆0.37± 0.04*#☆△0.03±0.02 0.12±0.03 GDNF mRNA 0.53±0.08*#0.44±0.05*#☆0.14± 0.02*#☆△0.01±0.01 0.03±0.03

表2 CCAM及CG1和CG2中Ki-67阳性细胞数目的比较（±s）

表2 CCAM及CG1和CG2中Ki-67阳性细胞数目的比较（±s）

与CG1组比：*P<0.01；与CG2组比：#P<0.01；与CCAMI组比：☆P<0.01

阳性细胞数40.26±3.69*#35.65±1.36*#☆32.89±2.05*#☆1.49±0.22 2.57 ±0.23组别CCAM I CCAM I I CCAM I I I CG1 CG2 n 35 15 8 10 10

2.2 Ki-67在CCAM中的表达 见表2。CCAM各亚型之间比较，CCAM I组明显较CCAM I I组和CCAM I I I组高（P<0.01）；CCAM I I组和CCAM I I I组比较差异无统计学意义（P>0.05）。CCAM组中，Ki-67表达较CG1组和CG2组明显升高（P<0.01）。

图5 GDNF和Ki-67在CCAM组中的表达

2.3 GDNF和Ki-67在CCAM和CG1与CG2组中的表达的比较 直线相关分析结果显示GDNF与Ki-67在CCAM组中的表达的关系：R=0.559，P<0.01，二者呈显著正相关。见图5。

2.4 CCAM组中GDNF基因序列的表达 用FFPET PCR提取CCAM和CG1组的GDNF DNA，未发现有基因表达的异常。

3 讨论

GDNF是Lin等[1]于1993年从大鼠胶质细胞来源的B49细胞株的无血清培养基中经浓缩、分离纯化并成功克隆的神经营养因子，GDNF主要对神经系统起营养调节作用[2]，同时它也在动物多种外周组织中起重要作用[3-4]。Ki-67抗原是存在于细胞周期G0以外所有阶段增殖细胞核的一种非组蛋白性核蛋白，它可全面反映细胞群体的增殖活性，是评估人类肿瘤、病变及正常组织增殖组分可靠及简单的方法[5]。

肺组织的形态形成受一系列不同转录因子及生长因子的调控。本研究结果发现，GDNF及其mRNA在CCAM组中的表达明显高于CG1组和CG2组，在CCAM各亚型中，GDNF的表达也是各不相同，提示GDNF与CCAM的形成有关，且与CCAMD不同类型的组织学发生有关。CCAM组中，Ki-67表达较CG1组和CG2组明显升高，提示CCAM存在细胞增殖的异常表达，并与GDNF共同参与CCAM的形成。研究[6]发现在CCAM产生的过程中，高表达的GDNF可以通过增加细胞周期蛋白的量和降低细胞周期蛋白的抑制物，从而加快细胞复制的过程，导致Ki-67表达升高。CCAM组中GDNF表达增加，导致胞内信号通路传导增强，转录过程加强，促进细胞增殖。本研究结果发现，GDNF和Ki-67在CCAM组和CG1组、CG2组中的表达二者呈正相关。因此认为GDNF可能通过影响细胞增殖来参与CCAM形成。研究中我们未发现CCAM组中有GDNF基因序列的异常，据此推测CCAM形成和GDNF基因表达异常可能无关，但还需要进一步研究证实。

Wiesenhofer等[7]研究表明，GDNF在胶质瘤中随着恶性程度的升高，该因子的表达水平也呈现增加的趋势，截止2010年已先后报道了与CCAM有关的上皮性或间叶性恶性肿瘤共35例。已有文献[8-9]报道肺囊性疾病中的CCAM与细支气管肺泡癌的发生有关。本研究GDNF和Ki-67在CCAM组中表达明显强于CG1组、CG2组，其中CCAM I型表达强度是最强的，可以提示CCAM不但是一种先天性畸形性疾病，也是一种促肿瘤性增生性疾病，并且本身可能具有恶性转化倾向，尤其是CCAM I型。

[1] Lin LF, Doherty DH, Lile JD, et al. GDNF: a glial cell linederived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons[J]. Science,1993, 260(5111):1130-1132.

[2] Aoi M , Date I, Tomita S, et al. Single administ ration of GDNF into the striatum induced protection and repair of the nigrost riatal dopaminergic system in the intrast riatal 6-hydroxydopamine injection model of hemiparkinsonism[J]. Restor Neurol Neuroscience,2001,17(1):31-38.

[3] Roussa E, Krieglstein K. GDNF promotes neuronal differentiation and dopaminergic development of mouse mesencephalic neurospheres[J]. Neurosci Lett,2004,361(1-3):52-55.

[4] Costantini F, Shakya R. GDNF/Ret signaling and the development of the kidney[J]. Bioessays,2006,28(2):117-127.

[5] 周玲玲,王宗敏,王利群,等.细胞增殖和凋亡在先天性肺囊肿形成中的作用[J].癌变·畸变·突变,2008,20(3):198-200.

[6] Calo V, Migliavacca M, Bazan V, et al.STAT proteins: from normal control of cellular events to tumorigenesis[J]. J Cell Physiol,2003,197(2):157-168.

[7] Wiesenhofer B, Stockhammer G, Kostron H,et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) and its receptor(GFR-alpha 1) are strongly expressed in human gliomas[J].Acta Neuropathol,2000,99(2):131-137.

[8] West D, Nicholson AG, Colquhoun I,et al. Bronchioloalveolar Carcinoma in congenital cystic adenomatoid malformation of Lung[J]. Ann Thorac Surg,2007,83(2):687-689.

[9] Lantuejoul S, Ferretti GR, Goldstraw P, et al.Metastases from bronchioloalveolar carcinomas associated with long-standing type 1 congenital cystic adenomatoid malformations. A report of two cases[J]. Histopathology,2006,48(2):204-206.