厚朴酚及和厚朴酚混合物的分离纯化研究

程新华,覃大吉，向极钎*,龙 澜

(1.湖北省农业科学创新中心鄂西综合试验站,湖北 恩施 445000; 2.恩施清江生物工程有限公司,湖北 恩施 445000)

目前，有很多提取制备厚朴酚及和厚朴酚混合物的文献报道[4-7]，但是将厚朴酚及和厚朴酚混合物分离纯化成单体的报道不多，赵春颖等[8]采用树脂分离、纯化厚朴总酚，但是厚朴酚纯度只能达到95%.中压硅胶层析具有较高分离效率，是分离纯化厚朴酚及和厚朴酚可行的方法.本文利用中压硅胶层析对厚朴酚及和厚朴酚混合酚进行初步分离，再利用85%甲醇重结晶，制备高纯度的厚朴酚与和厚朴酚单体.

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

高效液相色谱分析仪(2695分离单元+2696二极管矩阵检测器，美国waters公司)；BC-R205旋转蒸发仪(上海贝凯生物化工设备有限公司)；TU-1810紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；WRS-2A微机熔点仪(上海精密科学仪器有限公司)；中压层析系统(UV9091771218紫外检测器+HEP-200A恒流泵+500 mm×50 mm不锈钢层析柱+EasyChrom-1000色谱工作站，北京慧得易科技有限责任公司)；BT25S十万分之一电子天平(德国赛多利斯股份有限公司)；DZKW恒温水浴锅(北京永光明医疗仪器厂).

厚朴酚及和厚朴酚对照品(西安飞达生物技术有限公司)；厚朴酚及和厚朴酚混合物(自制，其中厚朴酚纯度为48%，和厚朴酚纯度为47%)；甲醇(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；乙腈(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；甲醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；乙酸乙酯(分析纯，武汉市江北化学试剂有限责任公司)；苯(分析纯，天津市福晨化学试剂厂)；60～90 ℃石油醚(分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司)；200～300目柱层析硅胶(青岛美高集团有限公司)；35 mm×75 mm薄层硅胶G板(青岛海浪硅胶干燥剂厂)；硫酸(分析纯，武汉市中天化工有限责任公司)；香草醛(分析纯，湖北健源生物科技有限公司).

1.2 实验方法

1.2.1 确定最佳的硅胶层析流动相 称取10 mg厚朴酚及和厚朴酚混合物，用甲醇溶解并定容至10 mL，作为供试溶液；另取厚朴酚、和厚朴酚对照品配制成1 mg/mL的甲醇溶液，作为对照品溶液；分别取上述的供试溶液和对照品溶液5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以展层剂展开，取出，晾干，然后喷以1%香草醛硫酸溶液，在100℃加热至斑点显色清晰.供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点.通过厚朴酚及和厚朴酚分开程度和Rf值确定最佳的展层剂即柱层析的流动相.

1.2.2 厚朴酚及和厚朴酚最佳吸收波长的确定 分别配制0.1 mg/mL厚朴酚以及和厚朴酚标准溶液，用TU-1810紫外-可见分光光度计进行波长扫描，确定最佳的吸收波长.

1.2.3 厚朴酚及和厚朴酚含量的测定 色谱柱：Kromasil 100-5C18(250 mm×4.6 mm)；流动相：乙腈-水(75∶35)；流速：1 mL/min；检测波长：294 nm；柱温：30℃.

标准曲线的绘制：用甲醇配制厚朴酚及和厚朴酚浓度均约为0.2 mg/mL的标准混合溶液.进样量分别为0、4、8、10、12、16、20 μL，用HPLC进行分析，以厚朴酚及和厚朴酚对照品质量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归.

152 程序性死亡配体 1 在索拉非尼耐药肝癌细胞中的表达和功能 孙非凡，李 东，李 华，王 涛，刘 煜，张 涛

厚朴酚的回归方程：

y=1 241 261.99x-104 234.57，R2=1.00；

和厚朴酚的回归方程：

y=1 553 096.8x-26 011，R2=1.00.

其中:x表示厚朴酚或和厚朴酚的质量，μg；y表示厚朴酚或和厚朴酚的色谱峰面积.样品溶液经0.45 μm微孔过滤器过滤，定量进样10 μL.

1.2.4 柱层析硅胶预处理以及装柱 把200～300目的柱层析硅胶于105 ℃活化2 h，然后加入柱层析流动相中，混匀，并且按同样方向不断的搅拌以去除其中的气泡.待没有气泡时，把硅胶缓缓加入含有少量流动相的硅胶柱中.在湿法装柱时，还需要轻轻敲打硅胶柱使硅胶填充均匀.待硅胶装满层析柱后，密封，然后用分离式液压起顶机把硅胶压实，压缩比为85%，装好的硅胶柱需用3～4 BV流动相冲洗并且平衡.硅胶柱中的硅胶总量约为400 g，柱体积为900 mL.

2 结果与讨论

2.1 确定最佳的展开剂

实验中考察了不同的展开剂，60℃～90℃石油醚-乙酸乙酯体系、60℃～90℃石油醚-乙酸乙酯-甲醇体系、60℃～90℃石油醚-甲醇体系、苯-甲醇体系，每种体系配制了一系列的不同配比.通过厚朴酚及和厚朴酚的分离度和Rf值确定最佳的展开剂配比.不同展开剂的分离效果见表1.

从表1可以看出，60℃～90℃石油醚-甲醇体系对厚朴酚及和厚朴酚混合物的分离效果不好，Rf值小，是由于该体系的极性小的缘故；60℃～90℃石油醚-甲醇体系Rf值适中，但是厚朴酚及和厚朴酚的分离度小，斑点有重叠现象，分离效果也不理想；苯-甲醇体系、60℃～90℃石油醚-乙酸乙酯-甲醇体系均能取得较好的分离效果，厚朴酚及和厚朴酚的斑点清晰，没有重叠现象，可以作为柱层析的流动相.

2.2 厚朴酚及和厚朴酚最佳吸收波长的确定

用甲醇溶解厚朴酚对照品，配制成0.5 mg/mL，用甲醇作空白对照，用紫外-可见分光光度计在190～400 nm进行扫描，全波长扫描图见图2.

表1 不同展开剂的分离效果

从图1可以看出，在波长290～294 nm处有较大的吸收值，250 nm处为溶剂的吸收峰，不能作为紫外检测的波长，所以确定290～294 nm为厚朴酚的最佳吸收波长，结果与文献一致[9].

2.3 中压硅胶层析分离厚朴酚及和厚朴酚混合物

2.3.1 不同层析流动相的分离效果比较 实验中考察了60℃～90℃石油醚-乙酸乙酯-甲醇(10∶0.5∶1)、60℃～90℃石油醚-乙酸乙酯(9∶1)、苯-甲醇(30∶1)这几种流动相对厚朴酚及和厚朴酚的分离效果.实验过程中，先用层析流动相平衡硅胶柱，待基线平稳时进行层析.湿法上样，样品用相应的流动相溶解，厚朴酚及和厚朴酚混合物的上样量为3.0～3.2 g，层析时的流速为40 mL/min，层析压力为3.2～4.5 kgf/cm2，用紫外检测器在线监测，并用色谱工作站对图谱进行分析处理.层析开始时，按每5 min分段收集流出液，当出现厚朴酚的色谱峰时，按每2 min分段收集流出液，直至色谱峰完全收集完毕.收集好的样品先用TLC进行分析，合并具有相同成分和纯度的样品，减压回收溶剂，干燥，即得到厚朴酚、和厚朴酚样品，最后用HPLC分析其纯度，并且计算产品的收率.不同层析流动相的分离效果见表2-4，分离色谱图见图2-4.

图1 厚朴酚全波长扫描图 图2 石油醚-乙酸乙酯-甲醇为流动相时的层析色谱图

从表2可以看出，正向硅胶层析时，厚朴酚较和厚朴酚先流出硅胶柱.厚朴酚流出时的纯度(7#)不高由于其中还有杂质一起流出色谱柱，继续收集时，厚朴酚的纯度逐渐升高(8#、9#)，纯度达到96%以上.当收集到10#样品时，和厚朴酚夹杂在厚朴酚的样品中，色谱图中也没有出现厚朴酚峰、和厚朴酚峰的分裂，只是一个单峰，厚朴酚、和厚朴酚色谱峰有严重的重叠现象，这样就造成厚朴酚、和厚朴酚的纯度都不高.随后样品中主要有和厚朴酚，纯度达到99%以上.和厚朴酚通过中压硅胶层析的纯度就可以达到98%以上，收率31%；厚朴酚通过中压硅胶层析的纯度可以达到96%以上，收率35%，但是要达到更高的纯度需要重结晶进一步的纯化.在厚朴酚、和厚朴酚混合样品(10#、11#)中，可以利用层析继续纯化.从色谱图2中可以看出，厚朴酚、和厚朴酚只有一个色谱峰，但是峰型较好，拖尾不严重.层析时所得样品的颜色为白色和浅黄色.

图3 石油醚-乙酸乙酯为流动相时的层析色谱图 图4 苯-甲醇为流动相时的层析色谱图

流动相名称流出液样品序号样品中厚朴酚纯度/%样品中和厚朴酚纯度/%样品收率/%783．610．841．88896．500．7616．73997．661．4519．18石油醚-乙酸乙酯-甲醇(10∶0．5∶1)1080．8418．788．62115．8692．4214．6012—99．3919．4713—99．6311．65

从表3可以看出，硅胶层析时，厚朴酚较和厚朴酚先流出硅胶柱.厚朴酚样品纯度达到96%以上的收率为17%，而和厚朴酚样品的纯度只有86%～92%，分离效果不好.从色谱图3中可以看出，厚朴酚、和厚朴酚只有一个色谱峰，但是峰型不好，拖尾非常严重，分离时间长，不适合作为中压硅胶层析流动相.层析时所得样品的颜色为白色和浅黄色.

表3 石油醚-乙酸乙酯流动相的层析分离结果Tab.3 Separation effect of Magnolol and Honokiol mixture using petroleum ether-ethyl acetate as deneloping solvent

从表4可以看出，硅胶层析时，厚朴酚较和厚朴酚先流出硅胶柱.厚朴酚样品纯度达到96%以上的收率为17.03%，而和厚朴酚样品的纯度只有85%左右，分离效果不好.从色谱图4中可以看出，厚朴酚、和厚朴酚只有一个色谱峰，但是色谱峰出现时间早，而且有点拖尾，分离效果不好，不适合作为中压硅胶层析流动相.层析时所得样品的颜色为浅黄色.

从表2-4可以看出，60℃～90℃石油醚-乙酸乙酯-甲醇流动相体系分离效果最好，通过层析就能使厚朴酚的纯度达到96%以上，和厚朴酚的纯度达到98%以上，收率为30%，而且样品的颜色为白色和浅黄色，色谱峰拖尾不严重，节省了分离时间.而石油醚-乙酸乙酯、苯-甲醇体系的分离效果不好，厚朴酚、和厚朴酚的样品纯度不高，样品颜色不好，而且色谱峰拖尾严重，增加了分离的时间.

表4 苯-甲醇流动相的层析分离结果Tab.4 Separation effect ofMagnolol and Honokiol mixture using benzene-methanol as deneloping solvent

2.3.2 不同流动相的流速对分离效果影响 实验中考察了30 mL/min和40 mL/min流动相的流速对厚朴酚及和厚朴酚的分离效果.实验过程中，先用60℃～90℃石油醚-乙酸乙酯-甲醇(10∶0.5∶1)流动相平衡硅胶柱，待基线平稳时进行层析.湿法上样，样品用相应的流动相溶解，厚朴酚及和厚朴酚混合物的上样量为3.0 g，层析时的流速分别为30 mL/min和40 mL/min，用紫外检测器在线监测，并用色谱工作站对图谱进行分析处理.层析开始时，按每5 min分段收集流出液，当出现厚朴酚的色谱峰时，按每2 min分段收集流出液，直至色谱峰完全收集完毕.收集好的样品先用TLC进行分析，合并具有相同成分和纯度的样品，减压回收溶剂，干燥，即得到厚朴酚、和厚朴酚样品，最后用HPLC分析其纯度，并且计算产品的收率.不同层析流动相的流速对厚朴酚及和厚朴酚的分离效果见表5和表6.

表5 流速为30 mL/min时的层析结果Tab.5 Separation effect of Magnolol and Honokiol mixture using 30 mL/min as flow velocity

表6 流速为40 mL/min时的层析结果Tab.6 Separation effect of Magnolol and Honokiol mixture using 40 mL/min as flow velocity

从表5-6可以看出，层析时，厚朴酚较和厚朴酚先流出硅胶柱.二者具有相似的分离行为，厚朴酚通过中压硅胶层析的纯度可以达到96%以上，收率35%，为了达到更高的纯度，厚朴酚样品需要通过重结晶进一步纯化；和厚朴酚纯度大于98%，收率30%左右.从二者的色谱图中可以看出，厚朴酚、和厚朴酚都只有一个色谱峰，但是，流动相流速大时，厚朴酚流出所需的时间短，反之亦然，而且流动相流速大时，可以节约分离时间和溶剂消耗，所以40 mL/min比30 mL/min流速分离效果好.

2.3.3 不同上样量对分离效果影响 实验中考察了不同上样量对厚朴酚及和厚朴酚的分离效果.实验过程中，先用60℃～90℃石油醚-乙酸乙酯-甲醇(10∶0.5∶1)流动相平衡硅胶柱，待基线平稳时进行层析.湿法上样，样品用流动相溶解，厚朴酚及和厚朴酚混合物的上样量分别为1.60、3.22、4.65和5.85 g，层析时的流速为40 mL/min，层析压力为3.2～4.5 kgf/cm2，用紫外检测器在线监测，并用色谱工作站对图谱进行分析处理.层析开始时，按每5 min分段收集流出液，当出现厚朴酚的色谱峰时，按每2 min分段收集流出液，直至色谱峰完全收集完毕.收集好的样品先用TLC进行分析，合并具有相同成分和纯度的样品，减压回收溶剂，干燥，即得到厚朴酚、和厚朴酚样品，最后用HPLC分析其纯度，并且计算产品的收率.不同层析流动相的分离效果见表7-10.

表7 上样量为1.60 g时的层析结果

表8 上样量为3.22 g时的层析结果

表9 上样量为5.85 g时的层析结果

表10 上样量为4.65 g时的层析结果

从表7-10可以看出，在上样量为1.60 g和3.22 g时，层析后的厚朴酚的纯度达到96%，和厚朴酚的纯度达到98%以上，分离效果较好；而上样量为4.65 g和5.85 g时，厚朴酚、和厚朴酚样品的纯度均均较低，说明分离效果不好.在上样量为1.60 g时，96%以上纯度的厚朴酚样品质量为0.42 g，98%以上纯度的和厚朴酚样品质量为0.73 g；在上样量为3.22 g时，96%以上纯度的厚朴酚样品质量为1.12 g，98%以上纯度的和厚朴酚样品质量为1.06 g，说明，上样量为3.22 g时比上样量1.60 g时更经济.综上，上样量为3 g左右是最佳的上样量.

2.4 重结晶纯化厚朴酚样品

通过硅胶层析分离后的和厚朴酚样品的纯度可以达到98%以上，但是厚朴酚样品的纯度只能达到92%～96%，有些和厚朴酚样品的纯度也只有92%左右，为了能够提高厚朴酚、和厚朴酚样品的纯度，需要进一步对厚朴酚样品进行重结晶纯化，以期达到98%以上的纯度.

重结晶的溶剂主要有甲醇、乙醇、乙酸乙酯、石油醚等.重结晶实验的原料为上述厚朴酚纯度92%～94%的样品、和厚朴酚纯度92%的样品.分别称取适量的样品，用重结晶溶剂在50℃溶解，加入的溶剂量令样品刚好溶解并处于饱合状态，把溶解液放入0℃～4℃冰箱中冷藏24 h，然后分离晶体和结晶母液，洗涤，真空干燥得厚朴酚、和厚朴酚重结晶样品.重结晶实验结果见表11.

表11 重结晶实验结果

从表11可以看出，厚朴酚在80%、85%和90%甲醇中均能够重结晶，而且重结晶后的纯度可以达到98%以上，在85%甲醇中重结晶时的收率最高，说明该重结晶溶剂最佳.而和厚朴酚在80%、85%和90%甲醇中不能析出晶体，故不能作为结晶溶剂.和厚朴酚在石油醚、石油醚-乙酸乙酯中虽然能够析出晶体，但是其中厚朴酚也同样能够析出晶体，这样就不能通过重结晶的方法把和厚朴酚样品进一步进行提纯.

上述层析和重结晶操作单元中未达到纯度要求的厚朴酚、和厚朴酚样品，回收后再进行硅胶层析和重结晶纯化，能够制备98%纯度的厚朴酚、和厚朴酚单体，提高了产品的收率.

3 结论

通过上述实验可知，中压硅胶层析分离厚朴酚及和厚朴酚混合物时，流动相为60℃～90℃石油醚-乙酸乙酯-甲醇(10∶0.5∶1)，流速为40 mL/min，上样量为3.0～3.2 g，层析时压力为3.2～4.5 kgf/cm2，用紫外检测器在线监测，并用色谱工作站对图谱进行分析处理.由于通过硅胶层析不能把厚朴酚、和厚朴酚分离成两个单独的色谱峰，即不能把二者完全分开，所以需要分段收集流出液，用TLC分析后，合并成分相同的样品，回收溶剂，真空干燥后可以得到厚朴酚纯度大于96%、和厚朴酚纯度大于98%的样品.通过硅胶层析后的厚朴酚样品用85%甲醇进行重结晶后，纯度大于98%，重结晶收率大于80%，达到纯度要求.

在硅胶层析和重结晶操作单元中未达到纯度要求的厚朴酚、和厚朴酚样品，回收后再进行硅胶层析和重结晶进一步纯化，能够制备98%纯度的厚朴酚、和厚朴酚单体，提高了产品的收率.

[1] 崔乘幸,许光日,汤波,等.中药厚朴中厚朴酚、和厚朴酚的提取研究[J].河南科技学院学报：自然科学版,2008,36(1):40-42.

[2] 中国药典编委会.中华人民共和国药典(2005版一部)[M].北京:化学工业出版社,2005：21-152.

[3] 林世俊,郑广东.厚朴不同炮制品含量测定的比较[J].中国中药杂志,2003,18(1):27-28.

[4] 姜宁,刘晓鹏.微波辅助提取厚朴中厚朴酚及和厚朴酚的研究[J].中华中医药杂志,2008,23(11):1012-1015.

[5] 宁华,王振宇,李颖,等.厚朴酚超声提取条件优选[J].中国公共卫生,2009,25(7):833-834.

[6] 周俊伟.正交试验法优选厚朴酚提取工艺[J].陕西中医学院学报,2006,29(6):59-60.

[7] 苏子仁,雷正杰,曾健青,等.超临界CO2萃取在厚朴提取工艺中的应用研究[J].中国中药杂志,2001,26(1):31-33.

[8] 赵春颖,毛晓霞,张梓倩.大孔吸附树脂分离纯化厚朴酚的方法研究[J].承德医学院学报,2009,26(4):358-360.

[9] 刘西茜,董慧茹.溶剂浮选-紫外分光光度法测定厚朴中总厚朴酚[J].分析试验室,2008,27(10):96-98.