响应面法优化平枝栒子多糖提取工艺研究

曾 智,郑小江,肖 浩,罗兴武

(1.生物资源保护与利用湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000； 2.湖北省生物医药产业药用植物资源开发利用技术创新基地，湖北 恩施 445000； 3.湖北民族学院 生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000)

平枝栒子[1-2](CotoneasterhorizontalisDecne)属于蔷薇目(Rosales)，蔷薇科(Rosaceae)，平枝栒子属(Cotoneaster).平枝栒子广布于我国陕西、甘肃、湖北、湖南、四川、贵州、云南.平枝枸子属落叶或半常绿匍匐灌木；高不超过0.5 m，枝水平开张成整齐两列状；小枝圆柱形，幼时外被糙付毛，老时脱落，黑褐色.叶片近圆形或宽椭圆形，稀倒卵形.花期5～6月，果期9～10月.

近年来，大量研究表明多糖除了有免疫调节、抗肿瘤的生物学效应、抗衰老、降血糖、抗凝血等[3]作用外，还具有抗氧化与抗病毒活性[4]，且其对机体毒副作用小.因此，对多糖的研究已经成为医药界的热门领域.响应面法(response surface methodology)[5]是采用多元二次回归方法作为函数估计的工具，与传统的“正交试验设计分析方法”相比，具有试验周期短，求得的回归方程精度高，能研究几种因素交互作用等优点[6-7].另外，王献等[8]分别采用热水浸提及超声波提取水溶性茯苓多糖，结果二者的提取率分别为13.0%和8.6%，表明热水浸提多糖得率高.因此本实验中采用热水浸提、响应面的方法来优化提取工艺，以期得到最佳的提取工艺条件.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

平枝栒子采自于湖北省农业科学院中药材研究所(恩施市新塘乡长岭岗).

无水乙醇(AR)、苯酚(AR)、浓硫酸(AR)、葡萄糖标准品(AR)、三氯甲烷(AR)、正丁醇(AR).

1.2 仪器与设备

FA-1004B电子天平 上海精密科学仪器有限公司；HWS12数显恒温水浴锅 上海一恒科技有限公司；低速大容量多管离心机 上海安亭科学仪器厂；紫外可见分光光度计TU-1810北京普析通用仪器有限责任公司.

表1 浸提温度对多糖提取率的影响

表2 浸提时间对多糖提取率的影响

1.3 方法

1.3.1 多糖提取工艺流程 平枝栒子→干燥→粉碎→浸提→定容→醇沉→去蛋白→取1 mL→测吸光度.

1.3.2 提取工艺的主要步骤 精确称取平枝栒子粉末0.5 mg置于50 mL的烧杯中，加入一定体积的蒸馏水，在一定温度下水浴一段时间，4 800 r/min离心30 min取上清液定容至25 mL，取5 mL加入3倍体积的无水乙醇于4℃冰箱中过夜，4 800 r/min离心15 min取沉淀定容至10 mL，加入sevage试剂2.4 mL去蛋白，然后取1 mL溶液测其吸光度.

1.3.3 多糖含量与提取率的测定

1.3.3.1 测定方法 多糖含量与提取率的测定：采用苯酚-硫酸法[9-12].精密吸取上述去蛋白后的样品液1.0 mL，加入1.0 mL 5%的苯酚溶液，然后加入5 mL 98%的浓H2SO4.摇匀后在40℃水浴中反应15 min，再在冷水中冷却10 min，在480 nm下测其吸光度.

1.3.3.2 标准曲线绘制 精密称取105℃下干燥至恒重的葡萄糖标准品10.00 mg，置于小烧杯中用蒸馏水溶解，再定容至25 mL，摇匀，即配得葡萄糖标准溶液.取7支干净的试管，分别精密吸取葡萄糖标准溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分别加入蒸馏水补至2.0 mL，按上述方法分别加入新鲜配制的5%苯酚溶液[13]1.0 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5.0 mL，摇匀后置40℃水浴中加热15 min，取出置冷水中冷却10 min，用分光光度计在波长480 nm处测定吸光度，得标准曲线方程：y=0.123 2x-0.000 3，R2=0.999 3.

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 浸提温度对平枝栒子多糖提取率的影响 精确称取平枝栒子粉0.5 g，每个梯度称取3份，选取时间2.0 h、料液比1∶12，分别在温度为50、60、70、80、90、99℃提取，测得平枝栒子多糖得率如图1中所示.

2.1.2 时间对平枝栒子多糖提取率的影响 精确称取平枝栒子粉0.5 g，每个梯度称取3份，在温度为90℃、料液比1∶12的条件下，各样品分别提取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h，结果见表2.

2.1.3 料液比对平枝栒子多糖提取率的影响 精确称取平枝栒子粉0.5 g，每个梯度称取3份，在温度90℃、提取时间2.5 h，各样品料液比分别为1∶8、1∶12；1∶16、1∶20、1∶24、1∶28，结果见表3.

表3 料液比对多糖提取率的影响

表4 响应面试验因素水平表

2.2 响应面法优化提取工艺条件

根据Box-benhnken的中心组合试验设计原理[5]，综合各单因素实验结果，以提取温度、料液比、浸提时间为因素，采用响应面分析方法进行试验设计，试验设计见表4.

对浸提时间、温度、料液比作如下变换：X1=(T-90)/9，X2=(z-20)/4，X3=(t-2.5)/0.5，以三次试验所得多糖提取率的平均值为响应值(Y)，设计试验与设计结果见表5，15个试验中，1～12是析因试验，13～15是中心试验，用来估计试验误差.

表5 响应面试验设计与数据处理

所得结果，用响应面分析软件分析得到如下的结果：

表6 Y的估计回归系数结果

表7 回归方程的方差分析

由表6结果可知：温度、浸提时间的一次方及其二次方、料液比的二次方对平枝栒子多糖的提取率影响都极显著(P<0.01).

通过软件分析结果得到平枝栒子多糖得率为响应值的最优方程为：

其中X1=(T-90)/9，X2=(t-2.5)/0.5，X3=(z-20)/4.

回归方程中各变量对指标(响应值)影响的显著性是由F检验来判定的，概率P越小，相应变量的显著性就越高.由表6可知，各因素的一次项及二次项对响应值的影响都是极显著的，交互项X2X3是显著的.同时由表7也可以看出，回归模型的相关系数R2=0.093 068/0.093 266=99.78%，回归方程也是极显著的.因此，该回归方程可以用来描述各因素与响应值之间的关系，进而确定平枝栒子多糖提取的最佳条件.对回归方程求一阶偏导数等于零，整理可得如下三式：

0.046-0.094X1=0

(1)

0.019-0.108X2-0.035X3=0

(2)

0.040-0.176X3-0.035X2=0

(3)

联立上述式(1)～(3)解方程组得:X1=0.489,X2=0.109,X3=0.206,代入X1=(T-90)/9，X2=(t-2.5)/0.5，X3=(z-20)/4,分别得到浸提温度T=94.4℃、料液比1∶20.824、浸提时间2.099h.但考虑到实际操作的便利，将其最佳提取工艺条件修正为提取温度94℃，料液比1∶21，浸提时间2.1h.

根据所得结果，由响应面分析软件得到如图1～3.

从图1～3上可以形象地看出各因素的交互作用对响应值(多糖得率)的影响.根据以上Box-benhnken的中心组合试验，得到平枝栒子的最佳提取工艺条件为：提取温度为95℃，料液比为1∶21，浸提时间2.1h.

3 结论

在单因素试验的基础上，通过Box-Benhnken设计及响应面分析，建立了响应值与各因素之间的数学模型，据此模型可以预测理论提取率为0.877%.据此二次回归模型，确定了平枝栒子多糖的最佳提取工艺：提取温度为95℃，料液比为1∶21，浸提时间2.1h.按此工艺条件提取平枝栒子多糖，其一次实际提取率可达0.865%.实际得率与理论值相差甚小，说明该模型能够很好地预测试验结果，可以简单快速地用来设计和分析各种与此相关的试验.

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