LC-MS/MS法测定人血浆中帕罗西汀及其药动学

张路平 任进民

LC-MS/MS法测定人血浆中帕罗西汀及其药动学

张路平 任进民

帕罗西汀;液相色谱-串联质谱;药动学

1 仪器与试药

API 4000型液相色谱-三重四极杆质谱联用仪，配有电喷雾离子化源和Analyst 1.4软件(美国ABI公司)。Prominence LC-20A液相色谱仪，配有二元梯度泵、在线脱气机、自动进样器和柱温箱(日本岛津公司)。

帕罗西汀对照品(中国药品生物制品检定所，含量97.4%，批号:100357-200301);维拉帕米对照品(中国药品生物制品检定所，批号:0223-9601);盐酸帕罗西汀片(北京万生药业有限责任公司，规格20 mg/片，批号090601);甲醇、乙腈为色谱纯，甲酸为分析纯，水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱-质谱条件 色谱条件:色谱柱 C 18柱(4.6 mm×50 mm，5 μm);流动相 2 mmol/L 甲酸水溶液(含0.1%甲酸)-乙腈(61∶39);流速 0 .5 ml/min;进样量 4 0 μl;柱温 2 0℃。

质谱条件:离子源 电喷雾离子化(ESI)源;喷雾电压5 500 V;雾化温度550℃;雾化气40 L/min;帘气25 L/min;碰撞气8 L/min;辅助气45 L/min;检测方式 正 离子多反应监测(MRM)。用于定量分析的离子反应分别为m/z 330.5→m/z 192.2(帕罗西汀)，m/z 455.5→m/z 165.2(内标，维拉帕米)，碰撞诱导解离(CID)电压均为30 V和45 V;驻留时间均为100 ms。

2.2 溶液配制 对照品贮备液:精密称取帕罗西汀对照品28.5 mg(相当于帕罗西汀25.0 mg)，置25 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容，得1.00 mg/ml的对照品贮备液。

内标溶液:精密称取维拉帕米对照品25.0 mg，置25 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容，作为内标贮备液。精密吸取维拉帕米储备液100 ml于10 ml量瓶中，用乙腈稀释并定容，混匀，再吸取此溶液250 ml于500 ml量瓶中，用乙腈稀释并定容配成浓度为5.00 ng/ml的内标工作液。

2.3 血样处理 精密吸取血样100 μl，加入内标工作液200 μl(5.0 ng/ml维拉帕米的乙腈溶液)，涡旋 3 0 s，6 000 r/min 离心5 min，精密吸取上清液 1 00 μl，加入水 0 .4 ml，涡旋 3 0 s，取样测定。

2.4 专属性试验 空白血浆、空白血浆加帕罗西汀(20.0 ng/ml)和内标 ( 5.0 ng/ml)、志愿者服药4 h后的血浆样品色谱图见图1。帕罗西汀与内标的保留时间分别为1.4和1.5 min，内源性物质不干扰测定。低、中、高3个浓度(0.50、4.0、16.0 ng/ml)血样的基质效应分别为 1 04%、104% 和100%，RSD(%，n=5)分别为5.8、7.3 和3.7。

图1 血浆中帕罗西汀的LC-MS/MS色谱图

2.5 线性试验 取空白血浆，制成含帕罗西汀200.0、100.0、40.0、15.0、5.00、2.00 ng/ml的系列浓度线性工作液，按照“2.3”项下方法操作后进样测定。以帕罗西汀与内标峰面积之比R为纵坐标，帕罗西汀浓度c为横坐标，进行线性回归，得回归方程为 R =0.0675c+0.00344，r=0.9998 。结果表明，帕罗西汀在0.20～20.0ng/ml浓度范围内线性关系良好。定量限为 0 .20 ng/ml。

2.6 精密度与回收率试验 按照2.3项下方法制备低、中、高3 个浓度(0.50、4.0、16.0 ng/ml)的血浆样品，各6 份，共4 批，分别进样测定，计算得日内、日间RSD(%，n=6)分别为2.7、2.2、3.8 和 1 1.3、10.8、5.7。方法回收率分别为 9 7.6%、97.5%、97.3%。同 上 制 备 低、中、高 浓 度 ( 0.50、4.0、16.0 ng/ml)的血浆样品，各6份，分别测定帕罗西汀的峰面积A1与相应浓度帕罗西汀溶液的峰面积A2，按A1/A2×100%计算 1 的提取回收率(%)，结果分别为90.7、93.8 和94.7(n=6)。内标的提取回收率为111.7%(n=9)。

2.7 稳定性试验 分别考察浓度为0.50和16.0 ng/ml的帕罗西汀血浆样品避光室温放置4 h、样品处理后室温放置24 h、冻融3次和冻存40 d的稳定性，所得帕罗西汀峰面积的RSD(%，n=3)均小于6.7%，表明血浆样品在上述条件下均稳定。

2.8 血药浓度测定 18名男性健康志愿者，年龄(21.4±1.5)岁，体重(63±7)kg，试验前经体检证实心、肝、肾功能和血糖等均正常，试验前2周及试验期间未用其他药物，本试验方案经医学伦理委员会审核批准。18名男性健康志愿者单剂量口服帕罗西汀片20 mg，分别于服药前和服药后 0.5、1、2、3、4、5、6、8、12、24、36、60、84、120 h 肘静脉取血 3 ml，置肝素离心管中，混匀后离心(6 000×g)10 min，分离血浆，－70℃保存，依法测定，平均药-时曲线见图2。主要药动学参数为 Cmax(9.33 ±5.54)ng/ml，tmax(5.28 ±1.56)h，t1/2(19.72 ±8.71)h，AUC0-120 h(221.6 ± 192.9)μg·ml－1· h－1和 AUC 0-∞(230.9 ±202.5)μg·ml－1·h－1。

图2 18名健康受试者口服帕罗西汀片后的平均药-时曲线

3 讨论

帕罗西汀的体内浓度较低，仍可用HPLC-UV法或HPLCMS法测定，但需要液液萃取或者固相萃取［1，2］，血样预处理比较繁琐，耗费时间，难以提高测定的样本量，因此选择使用LCMS/MS法。

本试验采用乙腈直接沉淀蛋白方法，经稀释后直接进样测定，结果表明本法专属性好，灵敏度、重现性均满足药动学和血样检测分析要求。本法血样预处理较文献［3］简便易行，两者灵敏度相似。

1 彭文兴，符棘玉，蒋丽丽，等.HPLC-MS法测定血浆中的帕罗西汀及人体内药动学研究.中国药学杂志，2003，38:868-870.

2 林治光，李华芳，翁毅仁，等.帕罗西汀片在健康志愿者体内的生物等效性.中国临床药学杂志，2005，14:231-233.

3 Massaroti P，Cassiano NM，Duarte LF，et al.Validation of a Selective Method for Determination of Paroxetine in human plasma by LC-MS/MS.J Pharm Pharmaceut Sci，2005，8:340-347.

R 917

A

1002－7386(2011)15－2357－02

10.3969/j.issn.1002 －7386.2011.15.075

050011 河北省石家庄市中心医院(张路平);河北医科大学第二医院(任进民)

帕罗西汀(Paroxetine)属强力、高度选择性的5-羟色胺(5-HT)再摄取抑制剂。其抗抑郁作用和治疗强迫性神经症、惊恐障碍及社交焦虑症的疗效被认为与其所具有的特异性抵制脑神经的5-HT再摄取有关。本品的化学结构不同三环类、四环类及现有的其他抑郁药。它对去甲肾上腺素、多巴胺再摄取的影响极小。体外放射性配体结合试验表明，本品和毒蕈碱受体、α1、α2、β受体、多巴胺受体几乎没有亲和性。现有文献报道的人体内帕罗西汀测定方法主要为HPLC法、HPLC-MS法等［1，2］，操作较繁琐、或者灵敏度较低，应用 LC-MS/MS 法较少［3］。本研究参考文献，以维拉帕米(verapamil)为内标，建立了LC-MS/MS法测定人血浆中的帕罗西汀，定量限为0.20 ng/ml，为帕罗西汀的血药浓度检测和药动学的研究提供参考。

2011－03－14)