千层塔孢子萌发研究初报

韦景枫 陶文丞 钟 漫 蒙先举 张声涛 覃凤好

(安顺市林业科学研究所，贵州 安顺 561000)

千层塔(HuperziaserratumThunb.),又名蛇足草、蛇足石杉等,为石杉科石杉属多年生草本植物[1]。千层塔全草入药,民间主治痈疖肿毒、跌打损伤等[2]。从“千层塔”中提取的生物碱——石杉碱甲是一种高效、可逆、选择性强的乙酰胆酯酶(AchE)抑制剂,对老年痴呆症有显著疗效,同时具有抗癌、抑制艾滋病毒、消炎等作用[3]。现存的该类植物大多生长缓慢，野生状态下千层塔的繁殖主要以孢子繁殖为主，孢子萌发周期长，萌发后属地下生配子体，需6～15年才能成熟[4]。不少研究人员曾开展千层塔组织培养研究,利用植物细胞工程方法生产石杉碱甲。但是,尽管采用了各种灭菌方法,植株总是带菌,研究发现千层塔健康植株中生活着内生真菌[5]。经过表面消毒灭菌处理后的外植体在培养基上生长一段时间,又会被内生真菌所污染[6～7]。千层塔孢子数量较多，是进行千层塔植株繁殖的有利条件，作者拟开展千层塔孢子培育研究,寻找一种新的孢子处理、培养方法，进行千层塔植株再生，实现野生资源的保存、开发和永续利用。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所用的千层塔植株于2009年5月采自贵州省雷山县，种植于安顺市林科所试验场以供实验取材。取孢子囊作为外植体。

1.2 外植体灭菌

外植体首先用自来水冲洗,然后在加有洗涤剂的水中浸洗 ,最后用清水冲洗干净。灭菌时在超净工作台上用70%酒精浸泡1min,然后用0.1%升汞灭菌3～4min，用无菌水冲洗4～5次，接种。

1.3 培养方法

把灭菌好的孢子囊先接种在不加激素的MS培养基上。15d后选出未污染和未白化的孢子囊继代到1/2MS和添加GA32mg·L-1、GA35mg·L-1、GA310mg·L-1的1/2MS培养基上(20g·L-1蔗糖，7g·L-1琼脂，pH6.0)。光照12h·d-1，光照度为24～30μmol·m-2·s-1，分别放在18～20℃、22～24℃、25～28℃下培养。每隔15d统计孢子囊的污染率和萌发率。

2 结果与分析

2.1 千层塔的外植体灭菌

采用0.1%升汞溶液灭菌，灭菌时间不同，产生的灭菌效果也不相同。处理外植体2～3min，大部分外植体在3～12d内，陆续出现污染，以真菌污染为主，细菌和杂菌污染为辅，说明灭菌时间过短，无法将表面污染源杀死；处理外植体4～5min，外植体培养在12d内出现的主要是真菌污染，呈红褐色和灰色等(图A，B)，污染的外植体很快被菌斑包裹，污染率为22.3%，此时的污染为外植体表面灭菌不彻底；处理外植体6～7min，大部分外植体陆续发白死亡，说明灭菌时间过长。

外植体培养43d后有的开始出现绿色细菌、白色细菌、绿色细菌伴有白色细菌、红色细菌、其他细菌和真菌污染等，细菌和真菌生长迅速，很快就包裹外植体( 图C，D，E)，120d统计污染率为71.2%。此时的污染主要为孢子囊内生菌。

总之，千层塔外植体的灭菌十分困难。用0.1%升汞，4～5min是比较好的，最后未出现污染的外植体为6.5%。

2.2 温度对千层塔孢子萌发的影响

千层塔孢子分别在18～20℃、22～24℃、25～28℃下培养。在18～20℃下培养的孢子到280d还未萌发，在22～24℃培养的孢子236d孢子萌发，在25～28℃下培养的孢子219d孢子萌发。实验表明，随着温度的升高有利于千层塔孢子的萌发，在25～28℃孢子萌发最快。

2.3 GA3对千层塔孢子萌发的影响

千层塔孢子分别在1/2MS和添加GA32mg·L-1、GA35mg·L-1、GA310mg·L-1培养基中培养。加GA35mg·L-1的孢子在培养219d后最先萌发，然后是加GA32mg·L-1的孢子在培养221d后萌发，加GA310mg·L-1的孢子未观察到有萌发的，1/2MS培养基孢子在培养284d后孢子萌发。实验表明，GA3对孢子萌发有促进作用，加GA35mg·L-1效果最好，可使孢子提前65d萌发(图F)。

3 讨论

经试验研究，千层塔的孢子已萌发，最适合孢子萌发的培养基为：1/2MS+GA35mg·L-1，培养温度在25～28℃。用千层塔的孢子囊作为外植体进行培养是一种比较好的材料，但孢子萌发要7个月以上，并且孢子萌发率较低，形成的配子体又很难分化出孢子体，下一步能否通过愈伤组织和GGB等途径来形成孢子体有待进一步研究。千层塔野生资源的再生较难，用生物技术的手段对这种珍贵的药用植物资源进行人工繁殖迫在眉睫，千层塔配子体是否含有石杉碱甲，能否从增殖的配子体上采取细胞培养提取石杉碱甲，还需进一步实验论证。

[1]丁景和.药用植物学[M].上海:上海科学技术出版社,1991:86.

[2]浙江省药用植物志编写组.浙江药用植物志[M].杭州:浙江科学技术出版社,1980:51.

[3]李军,韩燕.千层塔中三萜成分的研究[J].药学学报，1988,23(7):549.

[4]中山大学生物系,南京大学生物系.植物学[M].北京:人民教育出版社,1978:137.

[5]石玮,罗建平，丁振华,等.千层塔内生真菌分离鉴定的初步研究[J].中草药,2005,36(2):281～283.

[6]马华升,孙玉强,童建新,等.千层塔组织培养中外植体消毒灭菌研究初报[J].杭州农业科技,2008,(3):15～18.

[7]沈晓霞，俞旭平，盛束军.千层塔茎尖组织培养灭菌方法的研究[J].中国中药杂志，2002，27(6)：58.