仙茅药材的质量标准研究Δ

李隆云，马 鹏，喻 强，卫莹芳，钟国跃，王昌华（.重庆市中药研究院，重庆市400065；2.重庆市中药良种选育与评价工程技术研究中心，重庆市 400065；.成都中医药大学药学院，成都市 60075）

仙茅为仙茅科仙茅属植物仙茅Curculigo orchioides Gaertn.的干燥根茎，其性温、味苦，有小毒，具有温肾壮阳、祛寒除湿、益精血、强筋骨、行血消肿之功效。现代研究表明，仙茅具有耐缺氧、耐高温、镇静、抗惊厥、抗炎、抗菌、抗癌、抗衰老、提高免疫力和雄激素样作用等作用[1]。

仙茅主要分布于四川、贵州、云南、广西、广东等省（自治区），主要含有苷类化合物，其中仙茅苷是其特征性物质和活性物质。仙茅为野生药材，因生长年限、采集时期、生长环境的差异，导致其质量参差不齐，稳定性差，不能满足中药现代化对药材内在质量的要求。据研究[2]，仙茅药材均含有仙茅苷，但含量相差较大，如四川产仙茅中仙茅苷含量为0.152%、广东为0.139%、云南为0.065%、湖南为0.042%、广西为0.057%、贵州为0.024%。为客观评价仙茅药材质量，本文通过对主产地样品浸出物、总灰分、酸不溶性灰分及水分等药材常规理化测定项目进行考察，并对不同产地药材的仙茅苷含量进行测定，建立仙茅的现代质量评价标准与技术体系，以期提高仙茅质量控制水平，确保仙茅药材质量和临床疗效。

1 仪器与试药

2690高效液相色谱仪、996PAD二极管阵列检测器（美国Waters公司）；KQ-250B超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司，频率：40 kHz，功率：250 W）；AEG-45SM、AW-220电子天平（日本岛津公司）；Z-8000原子吸收分光光度计（日本日立公司）；AFS-2201原子荧光分光光度计（北京海光仪器公司）。

仙茅为31批采集于不同产地的野生药材样品和11批市售药材，用小型植物样品粉碎机粉碎，过三号筛，备用，所有药材经重庆市中药研究院秦松云和李泉森副研究员鉴定，均为仙茅科植物仙茅C.orchioides Gaertn.的干燥根茎；仙茅苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号：0771-200203）；砷、铅、汞、镉、铜的含量测定试剂分别按GB/T5009.11-2003、GB/T5009.12-2003、GB/T5009.17-2003、GB/T5009.15-2003、GB/T5009.13-2003规定使用优级纯或分析纯；甲醇为色谱纯，水为去离子水，其余试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 仙茅苷的含量测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱：TSK-GEL ODS-100s（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.1%乙酸水（33∶67）；流速：1 mL·min-1；柱温：35 ℃；检测波长：283 nm；进样量：10 μL。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.仙茅苷对照品；B.仙茅药材；1.仙茅苷Fig 1 HPLC chromatogramsA.curculigoside control；B.C.orchioides；1.curculigoside

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取仙茅苷对照品2.4 mg，置于5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，配制成浓度为0.48 mg·mL-1的溶液，即得。

2.1.3 供试品溶液的制备 取仙茅药材粉末0.5 g（过四号筛），精密称定，置100 mL圆底烧瓶中，加入甲醇50 mL，超声提取60 min，取出，滤过，回收甲醇，残渣用甲醇溶解，溶液置5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，备用。

2.1.4 标准曲线的制备 精密吸取仙茅苷对照品溶液1、2、4、8、10 μL，分别注入液相色谱仪，测定峰面积。以峰面积积分值（Y）为纵坐标，进样量（X）为横坐标，制备标准曲线，得回归方程为Y＝862 582.833 4X+20 246.252 4（r＝0.999 6，n＝5）。结果表明，仙茅苷进样量在0.48～4.8 μg范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。

2.1.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μL，在上述色谱条件下重复进样5次测定。结果，RSD＝1.5%（n＝5），表明仪器精密度良好。

2.1.6 加样回收率试验 取已知含量的样品（含量：1.7 mg·g-1）6份，每份约0.5 g，精密称定，按100%的比例精密加入对照品适量，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样测定，计算加样回收率。结果，平均回收率为99.97%，RSD＝2%（n＝6）。

2.2 样品提取条件的考察

2.2.1 提取溶剂的考察 取仙茅药材3份，各约0.5 g，精密称定，各置100 mL圆底烧瓶中，分别加入甲醇、乙醇、醋酸乙酯各50 mL，超声提取60 min，取出，滤过，回收甲醇，残渣用甲醇溶解，溶液置5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，备用。吸取上述3种溶液各10 μL，注入液相色谱仪，依法测定，计算仙茅苷的峰面积。结果，甲醇、乙醇、乙酸乙酯提取的仙茅苷峰面积分别为1 468 184、1 381 115、1 260 332，表明以甲醇作提取溶剂效果最好。

2.2.2 提取方法的考察 （1）甲醇回流提取：取仙茅药材粉末（过三号筛）约0.5 g，精密称定，置100 mL圆底烧瓶中，精密加入甲醇约50 mL，在70℃左右水浴中加热回流提取60 min，取出，滤过，滤液置100 mL烧瓶中，滤渣重复提取30 min，合并滤液，回收甲醇，残渣用甲醇溶解，溶液置5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液（Ⅰ）。（2）甲醇超声提取：取仙茅药材粉末（过三号筛）约0.5 g，精密称定，置100 mL圆底烧瓶中，加入甲醇约50 mL，静置1 h，超声处理30 min，取出，滤过，回收甲醇，残渣用甲醇溶解，溶液置5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液（Ⅱ）。（3）甲醇索氏提取：取仙茅药材粉末（过三号筛）约0.5 g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇50 mL，加热回流提取至提取液无色，滤过，将滤液转移至100 mL烧瓶中，回收甲醇，残渣用甲醇溶解，溶液置5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液（Ⅲ）。

吸取上述3种供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，依法测定。结果，3种方法得到的仙茅苷峰面积分别为1 455 137、1 038 865、1 185 500，表明水浴加热回流能更有效提取，故采用甲醇回流提取法提取。

2.2.3 提取时间的考察 分别取仙茅药材约0.5 g，精密称定，各置100 mL圆底烧瓶中，加入甲醇约50 mL，分别回流提取60、90、120 min。取出，滤过，回收甲醇，残渣用甲醇溶解，溶液置5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，备用。

吸取不同时间点提取的溶液各10 μL，注入液相色谱仪，依法测定，计算仙茅苷的峰面积。结果，提取60、90、120 min后仙茅苷的峰面积分别为1 482 772、1 548 732、1 551 914，表明提取90 min与提取120 min，仙茅苷的峰面积无显著差异，故以90 min为宜。

2.3 市售药材理化项目测定

选取11批市售药材，分别依照2010年版《中国药典》（一部）项下方法[3]进行浸出物、总灰分、酸不溶性灰分、水分、重金属及有害元素的限量检测。

3 结果

3.1 不同产地药材中仙茅苷含量测定结果

药材中仙茅苷含量在0.2%以上的产地有广西南丹县（市售，0.281%）、安徽亳州市（市售，0.274%）、云南文山县（0.216%）、贵州兴义县赵家沟（0.201%）、四川宜宾市观音镇（大，0.218%）、四川宜宾市明威乡（0.201%）等，仙茅苷高含量区域分布较广泛，没有明显的地域性；含量在0.15%～0.2%之间的有云南文山县1（市售，0.184%）、云南文山县2（市售，0.178%）、四川宜宾市观音镇（0.181%）、四川宜宾市观音镇（小，0.171%）、四川彭山县（市售，0.174%）；含量在0.1%～0.15%的有四川彭山县青年乡（0.125%）、四川宜宾市（市售，0.128%）、贵州独山县（市售，0.140%）等。以仙茅苷作为仙茅药材评价指标，四川宜宾地区的仙茅药材普遍含量高、品质好；云南地区如文山县（0.216%）、临沧市（0.114%）、罗平县（0.155%）、文山县医院（0.126%）、峨山县（0.120%）等地仙茅药材普遍含量较高，品质也较好。综上，全国仙茅药材的主产地，以四川、云南的仙茅药材质量最好。不同产地仙茅药材中仙茅苷含量比较见表1。

3.2 市售药材的理化项目测定结果

表1 不同产地仙茅药材中仙茅苷含量比较Tab 1 Comparison of the contents of curculigoside in C.orchioides from different habitats

3.2.1 浸出物含量 11批仙茅药材的水溶性浸出物含量（冷浸法）为16.44%～38.65%，水溶性浸出物含量以28.00%～35.00%居多，因此，仙茅药材的水溶性浸出物含量应规定不得低于20.00%为宜。药材中有四川宜宾市和安徽亳州市两个产地的醇浸出物（热浸法）含量低于7.0%，不符合2010年版《中国药典》（一部）规定；仙茅的醇溶性浸出物含量，以云南、广西的药材最高，达14.66%。11批仙茅药材醚溶性浸出物含量为1.49～2.23%，醚溶性浸出物含量以1.5～2.0%居多。因此，仙茅药材醚溶性浸出物含量应规定不得低于1.5%为宜。浸出物含量测定结果见表2。

3.2.2 总灰分、酸不溶性灰分的含量 11批不同产地仙茅药材的总灰分含量在7.53%～9.73%之间，符合2010年版《中国药典》（一部）中规定的不得过10.0%的要求；11个产地的药材中有3个产地的药材，其酸不溶性灰分含量超过2010年版《中国药典》（一部）中规定的不得过2.0%的要求，大部分批次药材的质量符合规定。总灰分、酸不溶性灰分的含量测定结果见表2。

3.2.3 水分 仙茅药材含水量最高达16.9%，最低为13.8%，均不符合2010年版《中国药典》（一部）规定的不得过13.0%的要求。水分含量测定结果见表2。

表2 市售仙茅药材的理化性质测定结果（n＝3）Tab 2 Physicochemical property of C.orchioides on the market（n＝3）

3.2.4 重金属含量 对6个不同产地药材的重金属含量检测结果表明，仙茅药材中的重金属砷、铅、汞、铜含量符合《药用植物及制剂绿色药材进出口行业标准》的规定，镉的含量则远＞0.3 mg·kg-1的标准规定，仙茅药材中重金属镉超标的原因有待进一步研究。重金属含量测定结果见表3。

4 讨论

4.1 色谱条件的考察

试验考察了甲醇-异丙醇-水、甲醇-水-冰醋酸、乙腈-水、甲醇-水等流动相，其中采用甲醇-异丙醇-水作流动相时，因异丙醇比重较大，出现柱压突然升高的现象，故放弃该流动相。以甲醇-0.1%乙酸水（33∶67）作为流动相较好，其目标峰峰形尖锐、对称、不拖尾，以仙茅苷计算，Rf＝1.65，理论板数＞8 000， 拖尾因子为1，流动相条件与潘馨等研究结果相同[4]。

表3 不同产地仙茅药材中重金属含量测定结果（mg·kg-1）Tab 3 Content determination of heavy metal in in C.orchioides from different habitats（mg·kg-1）

4.2 提取条件的考察

文献报道仙茅苷可溶于温水、甲醇、乙醇、正丁醇、醋酸乙酯等溶剂[5]，试验中比较过甲醇、乙醇、醋酸乙酯作为溶媒的方法，结果以甲醇为佳，故本文采用甲醇回流提取的方法。

4.3 仙茅药材中仙茅苷含量测定方法的确定

所测不同产地的42份仙茅药材样品中仙茅苷含量低于0.10%的有8份，故拟定仙茅药材按干燥品计算，含仙茅苷（C22H26O11）不得少于0.10%是可行的。

药典中仙茅苷含量测定法的流动相为乙腈-磷酸，而本法采用甲醇-水，仙茅苷的出峰时间比药典方法慢了1 min左右，但甲醇比乙腈低毒、价廉，故有推广价值。今后应对仙茅苷含量测定的提取方法进行改进，同时开展仙茅药材的薄层色谱鉴别和指纹图谱鉴别研究，建立更全面的质量控制指标。

仙茅药材的生长年限越长，植株根茎越大，药材中的仙茅苷含量就越高。野生仙茅药材的大小和生长年限不一，故采用野生药材进行不同采收期的研究无法论证本草文献记载的采收期的合理性。药材适宜采收期和采收年限的确定，必须通过人工种植，定点、定期的采集，进行含量与产量等系统研究方可确定。

[1] 高学敏.中药学（下册）[M].北京：人民卫生出版社，2000：683-684.

[2] 董国明，张汉明.不向产地仙茅药材薄层层析鉴别及仙茅苷的含量测定[J].中国现代应用药学杂志，1998，15（6）：48.

[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：附录62、附录53、附录52、附录50.

[4] 潘 馨，郭素华.高效液相色谱法测定仙茅中仙茅苷的含量[J].中国药学杂志，2002，37（5）：370.

[5] 徐俊平，董亲颐.仙茅化学成分研究[J].中草药，1986，17（6）：9.