天麻与钩藤配伍前后天麻素在SHR大鼠肝脏和肾脏的分布与归经探讨Δ

李 莹，李晓倩，王 兴，辛 秀，张卫国，王敏智（西南交通大学生命科学与工程学院，成都市 610031）

天麻是兰科植物天麻Gastrodia elata BL.的干燥块茎，性甘、味平，归肝经，为治疗肝阳上亢、肝风内动的要药。天麻中含有天麻素、异天麻素、香荚兰醇、香荚兰醛、天麻多糖等成分[1]。本研究通过测定天麻与钩藤配伍前后效应成分天麻素（Gastrodin）在SHR大鼠肝脏、肾脏的分布，讨论药对配伍作用对天麻素在大鼠体内分布过程的影响，初步探讨天麻的归经理论和药对配伍在归经中的意义。

1 仪器与材料

1.1 仪器

LC-20AT型高效液相色谱仪（日本岛津仪器有限公司）；TU-1901型双光束紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器责任有限公司）；MTN-2800W型氮吹浓缩装置（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。

1.2 试药

天麻、钩藤购自四川新荷花饮片公司，经西南交通大学生命科学与工程学院宋良科副教授鉴定为真品；天麻素对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110807-200205）；间苯三酚（北京化学试剂公司，批号：040401）；甲醇、乙腈（天津市科密欧化学试剂有限公司，色谱纯）；其余试剂为分析纯。

1.3 动物

14周龄SHR大鼠65只，♂，体重（270±20）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司（动物生产许可证号：SCXK（沪）2008-0005）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenence Luna C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-1%磷酸（3∶97）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：220 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取减压干燥后的天麻素对照品适量，加甲醇溶解并稀释成浓度为0.2 g·mL-1的天麻素对照品贮备溶液，备用。

2.2.2 内标溶液的制备 精密称取减压干燥后的内标间苯三酚适量，加甲醇溶解并稀释成浓度为0.4 g·mL-1的内标溶液，备用。

2.3 分组与给药

将65只SHR大鼠按体重随机分为3组，即对照（等容生理盐水）、天麻（0.95 g·kg-1）、天麻钩藤（2.2 g·kg-1）组。其中对照组5只，天麻组和天麻钩藤组分别按时间点细分为6个时间组，即15、30、60、120、180、240 min组，每组5只。制备0.1 g·mL-1的天麻混悬液、0.2 g·mL-1（天麻∶钩藤＝3∶4）的共煎液。按照陈奇主编的《中药药理学方法》中的给药量ig给药。大鼠日给药剂量＝人日给药剂量×6.17×校正系数。其中，校正系数为大鼠实际体重与大鼠标准体重的比值。

2.4 样品预处理

称取大鼠肝脏与肾脏组织，置于匀浆器中，加入2.5倍生理盐水，匀浆，3 000 r·min-1离心10 min，取上清液。精密吸取250 μL匀浆液，加8倍量甲醇和50 μL内标间苯三酚，涡旋混匀30 s，3 000 r·min-1离心5 min，取上清液，60 ℃水浴下氮吹干，100 μL 双蒸水复溶，静置 12 h，涡旋，10 000 r·min-1离心 10 min，取上清液，即得[2，3]。

2.5 标准曲线的制备

在8支塑料离心试管中，分别精密加入250 μL肝脏组织空白匀浆，再各加入50 μL内标溶液，将标准工作液配制成天麻素系列浓度分别为 200、50、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 μg·mL-1的样品。按“2.4”项下方法预处理样品，分别吸取10 μL进样。以样品浓度（X）为横坐标，样品峰面积与内标峰面积之比（Y）为纵坐标，进行线性回归，得天麻素在肝脏中的回归方程为Y＝0.008 2X－0.000 7（r＝0.999 5）；天麻素在肾脏中的回归方程为Y＝0.010 9X－0.001 6（r＝0.999 9）。结果表明，天麻素的检测浓度在0.312 5～200 μg·mL-1范围内同其峰面积与内标峰面积之比线性关系良好。

2.6 精密度与回收率试验

精密吸取250 μL大鼠肝脏、肾脏空白组织匀浆置于塑料离心管中，分别加入天麻素对照品贮备液适量，制成低、中、高浓度的样品液，肝脏为0.625、5、50 μg·mL-1，肾脏为0.625、5、40 μg·mL-1，按“2.4”项下方法预处理样品，并按“2.1”项下色谱条件测定，计算得浓度A。上述处理得到的样品分别在24 h内每隔6 h测定1次，求算日内精密度；并在连续4 d内每天测定1次，求算日间精密度。精密度试验结果见表1、表2。

精密吸取250 μL流动相，加入天麻素对照品贮备液适量，配制上述低、中、高浓度样品液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算得浓度B。浓度B与加入量真实值之比为方法回收率；浓度A与浓度B之比为提取回收率。回收率试验结果见表1、表2。

表1 肝脏样品的回收率和精密度试验结果Tab 1 Precision and recovery of liver tissue

表2 肾脏样品的回收率和精密度试验结果Tab 2 Precision and recovery of kidney tissue

2.7 稳定性试验

精密配制天麻素低、中、高浓度的肝匀浆（0.625、5、50 μg·mL-1）和肾匀浆（0.625、5、40 μg·mL-1）样品，置于－20 ℃冰箱30 d后，按“2.4”项下方法预处理，测得天麻素含量的RSD均＜5.7%；配制同样样品，置于－20℃冰箱保存24 h后室温解冻1 h，取出少量测定天麻素含量，其余继续－20℃冰箱保存24 h，反复冻融3次，测得天麻素含量的RSD均＜10%。可见，天麻素在肝、肾组织样品中有良好稳定性。

2.8 重复性试验

取同一份组织匀浆样品重复进样6次，测定天麻素含量，得RSD＝1.4%，表明该方法有良好重复性。

2.9 组织分布实验

将分组的SHR大鼠分别在末次给药的15、30、60、120、180、240 min，经股动脉及断头放血后，取出肝脏和肾脏制备匀浆液样品并进样测定。各时间点组织中的天麻素含量见表3。

表3 各时间点组织中的天麻素含量（mg·g-1）Tab 3 Content of gastrodin in tissue for each time point（mg·g-1）

配伍前后肝脏、肾脏的2组数据分别用SPSS17.0软件进行t检验，讨论是否有显著性差异。配伍前后显著性差异分析见表4。

表4 配伍前后显著性差异分析Tab 4 Analysis of significant difference before and after compatibility of G.elata and Uncariae Ramulus Cum Uncis Uncariae

由表4可见，肝脏、肾脏中配伍前后2组数据用t检验分析，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

研究结果表明，SHR大鼠ig天麻混悬液后，效应成分天麻素在肾脏内的最高血药浓度（Cmax）高于肝脏。这与文献[4]报道中使用放射自显影方法所测定的结果基本一致。但是在给予天麻钩藤水煎液后，效应成分的组织分布情况却出现了逆转。这说明并不能单纯地以使用单味药物时某些时间点中药有效成分在体内的选择性分布来论证中药的归经理论，还需从其与药物的配伍使用等方面来综合考虑。

根据数据显示，天麻与钩藤配伍后，天麻素在肝脏中Cmax增大，分布速率加快，消除速率加快；在肾脏中Cmax减小，消除速率减慢。综上结果，推论钩藤对天麻归肝经可能有协同增强作用。这与天麻钩藤饮方解中的天麻、钩藤共为君药，配伍使用以达平肝熄风之疗效[5]相一致。

研究数据显示，SHR大鼠ig天麻混悬液后，天麻素在肝脏的分布出现双峰，而在肾脏中并未出现此情况。据文献报道，某些采用正常大鼠血浆为对象进行的天麻素药动学研究中血浆浓度也出现了二次达峰的现象[4]，据此推断天麻素在大鼠体内的药动学过程可能存在“肝肠循环”的情况，本研究中肝脏二次达峰的现象可能与之有关。但是在已有的文献报道中，天麻素是否在大鼠体内存在肝肠循环还存在争议，故此具体的原因还需进一步进行论证。

数据显示，SHR大鼠ig天麻混悬液后，肝脏在180 min出现二次达峰，而天麻与钩藤配伍后双峰现象消失。这是否说明天麻与钩藤的配伍使用影响了天麻素的肝肠循环还有待于进一步的研究论证。

由本研究可知，天麻与钩藤的配伍使用对天麻中的效应成分天麻素在SHR大鼠体内的分布有较大影响，明显改变了天麻素的药动学过程。但是，产生这种影响的原因是否由于天麻、钩藤的配伍对天麻归肝经有协同加强的作用，还有待于通过其他大量的研究证实。

[1] 康延国.中药鉴定学[M].北京：中国中医药出版社，2005：237.

[2] 王 兴，胡瑞娟，黄 熙，等.RP-HPLC测定大鼠服用大川芎丸提取物后血浆中的天麻素[J].华西药学杂志，2003，18（5）：341.

[3] 程 刚，郝秀华，刘国良，等.天麻素在大鼠体内的药动学研究[J].中国药学杂志，2003，38（2）：128.

[4] 陆光伟，邹元杰，莫启忠.3H-天麻素在大鼠体内的吸收分布、代谢和排泄[J].药学学报，1985，20（3）：167.

[5] 段富津.方剂学[M].上海：上海科学技术出版社，2005：225.