蛇黄肝炎汤对小鼠急性肝损伤的保护作用研究Δ

林 慧，梅全喜，孔祥廉#，王书芹，王云庭（.广州中医药大学附属中山中医院，中山市528400；2.广东中山市中医药研究所，中山市 528400）

蛇黄肝炎汤为广州中医药大学附属中山中医院院内制剂，临床应用具有清热解毒、益气护肝等功效。本课题组通过前期实验，观察到蛇黄肝炎汤在乙型肝炎病毒（HBV）基因转染的人肝癌细胞系2215细胞培养中，对2215细胞分泌表面抗原（HBsAg）和e抗原（HBeAg）具有明显的抑制作用[1]，但对其肝损伤保护作用的研究尚属空白。因此，本研究采用四氯化碳（CCl4）制备小鼠急性肝损伤模型，探讨蛇黄肝炎汤对急性肝损伤的保护作用。

1 仪器与材料

1.1 仪器

UV-754型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；GL-20G-Ⅱ型高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；F6/10型超细匀浆机（弗鲁克（上海）流体机械制造有限公司）；微量移液器（上海求精生化试剂仪器有限公司）；BS224S型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；恒温水浴箱（上海衡平仪器仪表厂）。

1.2 试药

蛇黄肝炎汤由白花蛇舌草、田基黄、蒲公英、虎杖等9味中药组成，中药材购于广州致信中药饮片有限公司，由广州中医药大学附属中山中医院制剂室鉴定为真品并煎煮；联苯双酯滴丸（广州星群（药业）股份有限公司，批号：IF40003），临用前以超细匀浆机研磨成细末，加生理盐水溶解并经超声处理，配制成含药量为0.2 g·mL-1的溶液，备用；CCl4（分析纯，广州化学试剂公司）；橄榄油（化学纯，国药集团化学试剂有限公司，批号：F20100512）；丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.3 动物

健康SPF昆明种小鼠，♀♂兼半，体重（20±2）g，由广州中医药大学实验动物中心提供（动物生产许可证号：SYXK（粤）2008-0001）。实验前动物饲养于中山市中医院SPF级动物实验室，适应性饲养1周，按性别分笼饲养，自由进食、饮水，环境温度为（20±2）℃，相对湿度为70%。

2 方法

2.1 供试液的制备

取蛇黄肝炎汤各味干燥药材，用10倍体积的蒸馏水浸泡1 h，加热煮沸2 h，趁热过滤，药渣再加8倍体积的蒸馏水加热煮沸1 h，趁热过滤，合并2次滤液，浓缩至含生药量为0.67 g·mL-1的煎液，4℃贮藏，备用，临用前加蒸馏水稀释至所需浓度。

2.2 模型复制、分组和给药[2，3]

实验分为6组，即正常对照（等体积生理盐水）、模型（等体积生理盐水）、联苯双酯（3 g·kg-1）和蛇黄肝炎汤高、中、低剂量（60、40、20 g·kg-1，相当于成人临床日用量3、2、1倍的剂量）组。ig给药（0.15 mL·10 g-1），每天1次，连续7 d。于末次给药后1 h，除正常对照组外，其余各组均按0.1 mL·10 g-1容积一次性ip 0.1%CCl4，复制小鼠急性肝损伤模型（CCl4以橄榄油配制成0.1%的溶液）；正常对照组ip等量橄榄油。各组小鼠均禁食不禁水24 h。

2.3 标本采集

ip 0.1%CCl424 h后，摘眼球取全血，处死动物，摘取肝脏观察大体外观后，取同一肝叶用10%中性甲醛溶液固定，其余部分于－20℃贮藏，备用。

2.4 小鼠肝组织10%肝匀浆的制备

准确称取0.2 g肝组织块放入5 mL小烧杯中，加入冰冻生理盐水为匀浆递质，体积总量为肝组织块重量的9倍（W∶V＝1∶9），即用移液管量取冻生理盐水1.8 mL，用滴管取总量2/3的匀浆递质移到小烧杯内，小烧杯置冰水中，尽快以眼科剪剪碎肝组织块，超细匀浆机以10 000 r·min-1将其研磨成10%组织匀浆，匀浆时间10 s/次，间隙30 s，连续3次，使组织匀浆化（操作均在冰水中进行）。用剩余的1/3匀浆递质冲洗匀浆器，并合并倒入试管中，4℃下4 000 r·min-1离心15 min，轻轻吸取适量上清液进行SOD活性、MDA含量测定。

2.5 血清ALT、AST活性的测定（赖氏法）

摘眼球取血后，将血液放置约1 h，3 000 r·min-1离心15 min，轻轻吸取上清液，按试剂盒说明书以比色法测定并计算出相应ALT和AST的酶活力单位值。

2.6 肝组织匀浆MDA含量的检测（TBA法）

按试剂盒说明书步骤，将样品和各种试剂依次加入试管，用保鲜膜封闭管口后刺一小孔，95℃水浴40 min，取出后流水冷却，4 000 r·min-1离心10 min，吸取上清液，532 nm波长、1 cm光径、蒸馏水调零，比色法测各管吸光度值，计算MDA含量。肝组织匀浆的蛋白含量测定采用双缩脲法。

2.7 肝组织匀浆SOD活性的检测

按试剂盒说明书步骤，取上述制备好的10%肝组织匀浆上清液，用生理盐水按1∶9稀释成1%组织匀浆液，将样品和各种试剂依次加入试管，37℃水浴40 min，取出后加显色剂，室温放置10 min，550 nm波长、1 cm光径、蒸馏水调零，比色法测各管吸光度值，根据计算公式求出各样本中的SOD活性。

2.8 一般情况观察

各组小鼠的精神状态、活动、饮食、皮毛、体重。

2.9 统计学方法

实验数据以x±s 表示，用SPSS11.0统计软件分析。计量资料组间比较用One-WayANOVA方差分析。

3 结果

3.1 一般情况

实验期间正常对照组小鼠精神充沛，肢体灵活，饮食正常，皮毛整洁，无死亡；模型组小鼠精神萎靡，活动迟钝，饮食减少，皮毛凌乱；蛇黄肝炎汤高、中剂量组小鼠的精神、饮食等整体情况明显优于模型组和蛇黄肝炎汤低剂量组，但较正常对照组稍差。

3.2 蛇黄肝炎汤对模型小鼠血清ALT、AST活性的影响

与正常对照组比较，模型组小鼠血清ALT、AST活性显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，蛇黄肝炎汤高、中剂量组小鼠血清中的ALT、AST活性均显著降低（P＜0.05），提示蛇黄肝炎汤对急性肝损伤小鼠有一定的保护作用，且呈一定的剂量依赖关系。蛇黄肝炎汤对模型小鼠血清ALT、AST活性的影响见表1。

3.3 蛇黄肝炎汤对模型小鼠肝组织SOD活性、MDA含量的影响

与正常对照组比较，模型组小鼠肝组织MDA含量显著升高，同时SOD活性显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，蛇黄肝炎汤高、中剂量组小鼠肝组织MDA含量显著下降，SOD活性显著增强（P＜0.05），提示蛇黄肝炎汤有一定的抗脂质氧化作用且其作用呈一定的剂量依赖关系。蛇黄肝炎汤对模型小鼠肝组织SOD活性、MDA含量的影响见表2。

表1 蛇黄肝炎汤对模型小鼠血清ALT、AST活性的影响（±s，n＝12）Tab 1 Effect of Shehuang ganyan decoction on the activities ofALT andAST in model mic（e±s，n＝12）

表1 蛇黄肝炎汤对模型小鼠血清ALT、AST活性的影响（±s，n＝12）Tab 1 Effect of Shehuang ganyan decoction on the activities ofALT andAST in model mic（e±s，n＝12）

与正常对照组比较：＊P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

组别正常对照组模型组蛇黄肝炎汤高剂量组蛇黄肝炎汤中剂量组蛇黄肝炎汤低剂量组联苯双酯组ALT/U·L-1 49.52±10.23 159.55±49.55＊85.23±25.81#79.21±18.79#147.59±48.36 95.23±75.23#AST/U·L-1 76.38±11.89 201.45±83.94＊128.65±58.23#145.78±65.69#198.87±65.74 112.24±62.56#

表2 蛇黄肝炎汤对模型小鼠肝组织SOD活性、MDA含量的影响（±s，n＝12）Tab 2 Effect of Shehuang ganyan decoction on the activities of SOD and MDAcontent in model mic（e±s，n＝12）

表2 蛇黄肝炎汤对模型小鼠肝组织SOD活性、MDA含量的影响（±s，n＝12）Tab 2 Effect of Shehuang ganyan decoction on the activities of SOD and MDAcontent in model mic（e±s，n＝12）

与正常对照组比较：＊P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

MDA/U·mg-1 8.33±4.36 25.78±9.59＊17.56±8.12#15.47±7.25#23.51±8.93 16.72±7.64#组别正常对照组模型组蛇黄肝炎汤高剂量组蛇黄肝炎汤中剂量组蛇黄肝炎汤低剂量组联苯双酯组SOD/U·mg-1 65.32±7.89 32.58±8.45＊42.87±10.41#41.58±10.76#31.11±8.53 43.14±12.23#

3.4 蛇黄肝炎汤对模型肝损伤小鼠肝脏形态学的影响

正常对照组小鼠肝小叶结构清晰，肝细胞排列规则，肝索及肝窦延中央静脉呈放射状排列，肝细胞未见明显异常，未见炎症细胞浸润；模型组肝脏中央静脉和汇管区静脉周围可见淋巴细胞、中性粒细胞和多少不等噬酸性粒细胞浸润，汇管区周围肝细胞肿胀，胞质内可见红染颗粒，呈气球样变，部分细胞核碎裂、溶解，提示严重的肝脏炎症反应；蛇黄肝炎汤低剂量组肝脏中央静脉和汇管区静脉周围均可见淋巴细胞、中性粒细胞和少量噬酸性粒细胞浸润，静脉周围少许肝细胞肿胀，胞质内可见红染颗粒，呈气球样变，炎细胞浸润；蛇黄肝炎汤高、中剂量组肝脏病变均明显减轻，肝小叶结构较为清晰，大部分肝索排列整齐，少许肝细胞肿胀，且蛇黄肝炎汤高剂量组部分小鼠肝脏极个别肝细胞胞质内可见红染颗粒，肝细胞水肿程度比蛇黄肝炎汤中剂量组稍轻，炎细胞浸润不明显，提示其对肝脏的保护作用更加显著。小鼠肝脏病理组织形态学见图1。

4 讨论

CCl4肝损伤动物模型是一种比较经典的实验性肝损伤模型，而肝损伤是多种致病因素造成的肝脏病理过程的一部分，是肝纤维化和肝硬化的起始动因。我国卫生部颁布的《中药药理肝损实验指导原则》中明确制定应用CCl4肝损伤动物模型进行保肝降酶新药的药理实验，同时该模型亦被广泛用于肝细胞保护药物和保健食品的研究中[4，5]。本研究采用广州中医药大学附属中山中医院自行研制的蛇黄肝炎汤，对CCl4致肝损伤小鼠模型进行实验性治疗。方中白花蛇舌草具清热解毒、消痈利尿之功，以其为主药的蛇黄肝炎汤对大鼠CCl4所致肝炎有保护作用；田基黄对CCl4所致小鼠肝组织及原代培养大鼠肝细胞损伤有保护作用[6]；蒲公英能显著缓解CCl4肝损伤引起的组织学改变，有保肝利胆作用；虎杖有效成分藜芦酚可体外抑制肝微粒体脂质过氧化反应而具护肝作用[7]。

图1 小鼠肝脏病理组织形态学（200×）A.正常对照组；B.模型组；C.蛇黄肝炎汤高剂量组；D.蛇黄肝炎汤中剂量组；E.蛇黄肝炎汤低剂量组；F.联苯双酯组Fig 1 histopathological morphology of mice’s liver（200×）A.normal control group；B.model group；C.Shehuang ganyan decoction high-dose group；D.Shehuang ganyan decoction medium-dose group；E.Shehuang ganyan decoction low-dose group；F.bifendate group

本研究表明，模型组较正常对照组血清ALT、AST活性显著升高，结合病理组织学检查，表明CCl4所致小鼠急性肝损伤模型复制成功。高、中剂量蛇黄肝炎汤均能显著降低由CCl4所致小鼠血清ALT、AST活性的升高，其降低作用与目前公认的降氨基酸转移酶药联苯双酯较为接近。高、中剂量蛇黄肝炎汤能显著降低模型小鼠肝组织匀浆液中的MDA含量，并显著升高SOD活性。肝病理切片显示，各剂量蛇黄肝炎汤组均较模型组病理损伤减轻，量效关系明显，且蛇黄肝炎汤高、中剂量组的肝保护作用优于联苯双酯组，表明蛇黄肝炎汤具有增强肝脏抗氧化能力、减轻脂质过氧化物生成和保护肝脏的作用。

综上所述，蛇黄肝炎汤对CCl4所致小鼠急性肝损伤有一定的保护作用，且其保护作用可能与抑制自由基的产生、减少脂质过氧化有关。

[1] 孔祥廉，林 慧，梅全喜，等.蛇黄肝炎合剂对2215细胞分泌HBsAg及HBeAg的抑制作用[J].中华中医药学刊，2010，28（8）：1 703.

[2] 李仪奎.中药药理实验方法学[M].上海：上海科学技术出版社，1999：158.

[3] 王福根，孙静霞.肝损伤动物模型的建立和应用[J].中国药房，2006，17（9）：702.

[4] 中华人民共和国卫生部.保健食品检验与评价技术规范[S].北京：清华同方出版社，2003：133.

[5] 江泉观，纪云晶，常云勋.环境化学毒物防治手册[M].北京：化学工业出版社，2004：515.

[6] 梅全喜.广东地产药材研究[M].广州：广东科技出版社，2011：281、257．

[7] 梅全喜.现代中药药理与临床应用手册[M].北京：中国中医药出版社，2008：175、597.