SPE-LC/MS/MS法同时测定烟叶中5种新烟碱类杀虫剂残留

何庆，徐迎波，王程辉，田振锋，朱栋梁

安徽中烟工业公司技术中心，合肥市高新区天达路9号230088

新烟碱类杀虫剂是一类高效、安全、高选择性的新型杀虫剂，作为后突触烟碱乙酰胆碱受体（nAChRs）的激动剂作用于昆虫中枢神经系统［1］，具有高杀虫活性，而对哺乳动物低毒，在国内外市场的销量发展很快。据预测，今后5年内，新烟碱类杀虫剂将占全球农药总量的15%～20%。其中，“烯啶虫胺”、“吡虫啉”和“啶虫咪”（图1）均是1990s年代日本开发出来的，目前国内已有企业生产。而“噻虫啉”和“噻虫嗪”自2001年注册使用，目前均在专利保护期内。此类杀虫剂单一残留量的检测方法已有报道，如Navalon等［2］采用GC/MS测定蔬菜残留“吡虫啉”，Tokieda等［3］利用GC连接电子捕获检测器检测“啶虫咪”含量。采用GC方法均会涉及到水解或者氧化的前处理过程，实验较为繁琐。Sasaki等［4］指出，由于基质效应的存在，利用GC检测农药残留往往会得到过高的结果。人们逐渐发现，液相色谱（LC）法更适合于此类杀虫剂的检测，如Fernandez-Alba等［5］采用HPLC-UV测定蔬果中“吡虫啉”残留，并用LC-MS证实了其准确性，韩振泰等［6］利用反向HPLC测定了“噻虫啉”残留，此方法也被用于“噻虫嗪”含量的检测［7-8］。然而，这些方法均需要二氯甲烷或者氯仿为萃取溶剂，对环境不友好。因此，进行了本研究，旨在建立一种同时检测烟草中5种新烟碱类杀虫剂（图1）残留的方法，也为其他食品中此类杀虫剂的检测提供参考。

图15 种新烟碱类杀虫剂结构式

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

甲醇（色谱纯，美国Tedia公司）；醋酸铵（AR，上海试剂厂）；超纯水；“啶虫咪”标样（纯度99%，德国Dr.Ehrenstorfer公司）；“烯啶虫胺”、“吡虫啉”、“噻虫嗪”、“噻虫啉”（标样，纯度99.5%，美国AccuStandard公司）；无农药残留的空白烟叶样品（取自中国科学技术大学烟草实验基地温室中以蛭石为基质的盆钵中种植的K326烟株）。

4000 Q Trap质谱仪（美国应用生物系统公司）；Waters Acquity超高压液相色谱仪（UPLC，美国Waters公司）；Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司）；RE-2000旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；JK-250B超声波清洗器（合肥金尼克机械制造有限公司）；Cleanert Pesticarb SPE柱（500 mg/6 mL，天津博纳艾杰尔科技有限公司）；Supelclean Envi-18 SPE柱、Supelclean Envi-Chrom P SPE柱（500 mg/6 mL，美国Supelco公司）；SampliQ Silica SPE柱（500 mg/6 mL，美国Agilent公司）；AL204-IC电子天平（感量：0.0001 g，瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 样品处理［9］与分析［10］

准确称取5.0 g烟末样品，置于50 mL三角瓶中，加入20 mL 20%甲醇水溶液，室温下超声萃取10 min，过滤，用5 mL 20%甲醇水溶液洗涤滤渣和滤纸，液洗涤与滤液合并，共25 mL。取10 mL滤液，倾入Cleanert Pesticarb SPE柱上，缓慢施压逐滴滴下，流尽后，流出液舍弃，用30 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，40℃，9.81 kPa下旋蒸至近干，N2吹干，用无水甲醇溶解并定容至1 mL，过0.22 μm微孔滤膜，滤液进行LC-MS/MS分析。采用比较与标样色谱峰保留时间定性，外标工作曲线定量。测定条件为：

色谱柱：Waters Acquity UPLC Ben C18柱（2.1 mm×50 mm i.d.，1.7 μm d.f.）；柱温：25℃；流动相：甲醇（A）和0.1%醋酸铵水溶液（B）；流速：0.6 mL/min；梯度洗脱：5%A+95%（0～3 min），40%A+60%B（3～10 min），60%A+40%B（10～15 min），100%A（15～20 min）；进样量：10μL。

电离模式：电喷雾（ESI）正离子模式；电喷雾电压：3000 V；检测模式：多反应监测模式（MRM，表1）；离子源温度：550℃；扫描时间：100 ms。

2 结果与讨论

2.1 SPE条件的选择

固相萃取（SPE）被广泛应用于农药及其共萃物的分离［11-12］。以往的SPE方法中，一般先用水溶性溶剂萃取，萃取液浓缩后再进行SPE，较为费时。Carbras。等［13］分析低酒精含量的溶液如白酒中的杀虫剂时，建立了一种样品不经浓缩直接SPE的方法。这也表明，如果SPE柱对被分析物的吸附能力足够大，只要在萃取溶剂中降低有机溶剂的含量，就可以在保证萃取效率的同时，增大SPE柱对这5种杀虫剂的保留能力，然后利用强极性溶剂将其洗脱［14］，这样可以省去萃取液浓缩步骤，直接上样。基于此种考虑，本研究比较了不同甲醇浓度水溶液的萃取效率，萃取液不经过浓缩，直接进行SPE，通过5种杀虫剂回收率的检测，同时也比较了4种类型SPE柱，分别为Silica硅胶柱、Pesticarb石墨化碳柱、C18柱，以及Envi-Chrom P聚苯乙烯二乙烯基苯柱对这5种新烟碱类杀虫剂的保留能力，结果见表1。从表1可以看出，石墨化碳柱和聚合物柱对这5种杀虫剂的保留能力均强于C18柱，硅胶柱的保留能力最弱。这与Kaufmann的结论一致［15］，Kaufmann认为，农残分析时，石墨化碳或者聚合物柱的纯化效果比C18和C8柱要好，聚合物柱不适合于“烯啶虫胺”的分析。因此，选择20%甲醇水溶液作萃取剂，CleanertPesticarb石墨化碳柱作SPE柱。而后，比较了不同体积甲醇对这5种新烟碱类杀虫剂的洗脱效率，结果见表2。由表2看出，30 mL甲醇既可以将这5种杀虫剂全部洗脱，而且洗脱液浓缩后颜色为无色至淡黄，避免了烟草色素对液相色谱柱的污染。

表1 不同甲醇浓度萃取剂、SPE柱类的5种新烟碱类杀虫剂的回收率①（%）

表2 不同体积甲醇洗脱剂的5种新烟碱类杀虫剂回收率（%）

2.2 LC-MS/MS条件的确定

石隆平等［10］在分析“烯啶虫胺”原药纯度时，选择流动相甲醇和水梯度洗脱：100%水20 min内至50%甲醇和50%水，将“烯啶虫胺”与杂质分离。吴培等［16］发现，采用40%甲醇和60%水可使烯啶虫胺分离。而曹爱华等［9］发现，采用甲醇/水（60/40）作流动相，可使“吡虫啉”良好分离。本实验最初选择由少量甲醇（5%）组成流动相，缩短了“烯啶虫胺”的出峰时间，梯度洗脱至40%甲醇，可使“烯啶虫胺”的完全分离。梯度洗脱至60%甲醇，“吡虫啉”，“啶虫咪”，“噻虫啉”和“噻虫嗪”得到完全分离（图2），而醋酸铵的加入，有利于样品的正离子化效率［17］。

图2 混合标准样品的MRM图

质谱采用多反应检测模式（MRM），实验确定［M+1］+为母离子，以手动进样选择监测离子对，确定2对离子对作为每种杀虫剂监测离子对，1对为定量离子对，1对为辅助定性离子对，分别对各离子对离子化以及质谱参数进行了优化，结果见表3。

表3 5种新烟碱类杀虫剂的MRM参数①

2.3 工作曲线与检测限

准确称量“烯啶虫胺”、“噻虫嗪”、“吡虫啉”、“啶虫咪”和“噻虫啉”各10 mg，分别置于5个100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得浓度100 μg/mL标准储备溶液。移取“烯啶虫胺”、“噻虫嗪”、“吡虫啉”、“啶虫咪”和“噻虫啉”的标准储备溶液各10 mL，倾于同一只100 mL容量瓶中，用甲醇定容，得浓度为10 μg/mL的混合标准溶液，同样方法得到浓度为5.0，2.0，1.0，0.5和0.1 μg/mL混合标准溶液。将6个浓度的混合标准溶液按浓度由低到高的顺序进样进行LC-MS/MS分析，并以峰面积（y）对其相应浓度（x，μg/mL）进行线性回归分析，得到各组分的工作曲线回归方程及相关系数（表4）。取最低浓度的标准溶液，连续进样10次，并计算这些数据的标准偏差（SD），以3倍SD和10倍SD分别作为仪器的检测限和定量限，结果见表4。可以看出，在设定0.1～10 μg/mL浓度范围内，5种杀虫剂线性关系良好，适合于定量分析。

2.4 回收率与重复性

取2份（5 g/份）无农药残留的空白烟叶样品中分别添加0.10和1.00 mg/kg的混合标准溶液，然后用本方法测定各组分含量，并根据测定量和加标量计算回收率，结果见表5。由表5可以看出，在0.10和1.00 mg/kg添加水平下，5种杀虫剂的回收率在80%～92%之间。3次平行测定，5种杀虫剂的相对标准偏差（RSD）分别为2.58%，2.50%，3.83%，2.59%，4.08%，说明本方法准确度和重复性均达到了农残分析的要求。

表4 标准曲线及检测限

表5 5种杀虫剂的回收率（%）

3 结论

建立了一种甲醇水溶液萃取，Pesticarb石墨化碳柱净化，LC-MS/MS同时检测烟叶5种新烟碱类杀虫剂的方法。本方法操作简便，准确性和重复性均较好，适合于烟叶中新烟碱类杀虫剂的残留分析。

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