HPLC法测定烟草及烟草制品中马来酰肼残留

张洪非，边照阳，唐纲岭，胡清源

中国烟草总公司郑州烟草研究院国家烟草质量监督检验中心，郑州高新技术产业开发区枫杨街2号450001

马来酰肼（MH）又称抑芽丹，化学名6-羟基-2H-哒嗪-3-酮［1］，纯品为白色结晶粉末，大鼠急性经口LD50＞5000 mg/kg［2］，是一种烟草抑芽剂。1980年，ISO颁布了分光光度法测定烟草和烟草制品中的MH残留量标准［3］。1991年，Yang［4］用胶束液相色谱法（MLC）测定了烟草中的MH残留量，同时还比较了几种前处理方法的优缺点。1992年，Renaud等［5］采用衍生化-GC法分析了烤烟中的MH残留量。1996年，John Lewis等［6］和1999年Dias等［7］先后采用HPLC法分析了马铃薯中的MH。Kubilius等［8-9］采用毛细管电泳法测定了土豆和洋葱中的MH残留。Cho［10］采用毛细管电泳法研究了蔬菜和水果中的MH残留。裴明黎等［11］、杨昀等［12］采用HPLC法分别测定了马铃薯、烟叶和土壤中的MH，但后者方法的检出限较高，不能满足MH的检测需要［13］。GB/T 19611—2004也规定采用分光光度法测定烟草和烟草制品中的MH［14］。然而，此标准前处理繁琐，每人每天仅能分析5～7个样品，因此，进行了本研究，目的是建立一种快速测定烟草及烟草制品中马来酰肼残留的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

Agilent 1200效液相色谱仪（美国Agilent公司），配置VWD紫外检测器；Milli-Q50超纯水处理仪（美国Millipoer公司）；PHS-3C型精密pH计（上海雷磁仪器厂）；ZNHW电加热套（河南豫华仪器有限公司）；Suplco C18固相萃取小柱（美国Suplco公司）；AE 163电子天平（感量：0.0001 g，瑞士Mettler公司）。

马来酰肼（97.5%，德国Dr.Ehrenstorfer公司）；冰乙酸、醋酸铵（HPLC级，美国Tedia公司）；超纯水（电阻率18 MΩ·cm）；2009年进口津巴布韦烤烟烟叶L1MF样品（2009年国家局烟草农药残留普查分析样品）。

1.2 样品处理与分析

准确称取5.00 g 40目烟末，置于250 mL磨口圆底烧瓶中，加入50 mL 4 mol/L盐酸，将圆底烧瓶放入电加热套中加热回流1 h，待回流完毕，冷却至室温，过滤，用4 mol/L盐酸淋洗冷凝管和萃取过的烟末，合并滤液和淋洗液至100 mL容量瓶中，用4 mol/L盐酸定容。准确移取2 mL烟末处理液，倾入预处理（依次用2 mL甲醇和2 mL 0.1 mol/L氢氧化钠水溶液淋洗）过的C18固相萃取小柱中，接收流出液，用2 mL 0.1 mol/L氢氧化钠水溶液洗脱［6］，收集洗脱液，合并流出液和洗脱液，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液定容至5 mL，过0.45 μm水相滤膜，滤液取样进行HPLC分析。采用比较标样保留时间法定性，采用外标法定量。分析条件为：

色谱柱：Varian Microsorb-MV 100-5 C18（250 mm×4.6 mm）柱；流动相：0.1 mol/L（pH4.8）醋酸水溶液；等度洗脱；流速：0.7 mL/min；检测波长：313 nm；柱温：30℃；进样量：10 μL。

2 结果与讨论

2.1 萃取溶剂和萃取方式的选择

为选择适宜的萃取溶剂，考察了甲醇、酸化甲醇（100体积80%甲醇＋1体积4 mol/L盐酸），以及1，2，3，4，5，6和7 mol/L盐酸作萃取溶剂［11-13］时MH的回收率，结果甲醇、酸化甲醇和1，2，3，4，5，6和7 mol/L盐酸的萃取回收率分别为45.68%，54.23%，77.58%，85.64%，89.92%，94.02%，93.69%，93.54%和92.87%。由此可以看出，当盐酸浓度为4 mol/L时萃取回收率达到稳定，随着盐酸浓度的升高，回收率并没有明显的升高；不同浓度盐酸的回收率均高于甲醇和酸化甲醇，可能是因为MH在烟叶中主要以自由态和结合态存在［4］，而甲醇只能提取烟叶中自由态的MH，酸化甲醇能提取烟叶中自由态和部分结合态的MH，而盐酸溶液则能使烟叶中结合态的MH水解，从而提高了回收率。因此，选用4 mol/L盐酸作为MH的萃取溶剂。

MH的萃取方式有超声和加热回流2种方式［4，11］，为了提高烟叶中MH的萃取效率，以4 mol/L盐酸作萃取溶剂，考察了振荡、超声、微波和加热回流萃取的回收率。结果表明，振荡、超声法、微波和加热回流萃取的回收率分别为25.12%，30.52%，38.17%和94.02%；这表明振荡、超声和微波法不能有效地萃取样品中的MH，而加热回流的萃取方式则可以有效地萃取样品中残留的MH。

同理，考察了不同萃取温度和萃取时间对萃取回收率的影响，结果见表1。从表1可以看出，180℃下萃取1 h的萃取回收率较高，且重复性较好。故选择180℃下萃取1 h。

2.2 固相萃取小柱的选择

分别考察了Suplco，Agilent，Waters和AgelaC18固相萃取小柱［4，11］对样品萃取液的净化效果及其固相萃取的回收率，结果Suplco，Agilent，Waters和Agela C18固相萃取小柱的回收率分别为96.34%，60.48%，66.21%和65.24%。由此可以看出，在考察的4种固相萃取小柱中，Suplco C18小柱的回收率最高，可以满足在对样品净化的同时而不吸附目标物的效果。因此，选择Suplco C18小柱作固相萃取净化柱。

2.3 色谱条件的选择

2.3.1 检测波长

对文献［6-7，11-12］中报道的检测波长205，220，236，313 nm进行了比较，结果如图1所示。由图1可以看出，当检测波长为313 nm时响应最高。因此，选择检测波长313 nm。

2.3.2 色谱柱

为达到较好的分离效果，分别考察了Eclipse XDS C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），Eclipse XDS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），Agela XDB C1（84.6 mm×250 mm，5 μm），Varian Omnispher C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）和Varian Microsorb-MV 100-5 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱作色谱柱的分离效率，结果如图2所示。从图2可以看出，在以0.1 mol/L（pH4.8）醋酸水溶液作流动相条件下，唯有Varian Microsorb-MV 100-5 C18柱可以将MH和杂质峰有效分离，从而实现对MH的定性和定量分析。因此，选择Varian Microsorb-MV 100-5 C18柱作分离MH的色谱柱，在此条件下，MH的保留时间为7.789 min。

图1 不同波长下MH响应

2.3.3 流动相

为选择适宜的流动相，以Varian Microsorb-MV 100-5 C18柱作色谱柱，分别考察了乙腈∶水（体积比10∶90）［11］、甲醇∶水（体积比10∶90，pH2.7）［11］、甲醇∶水（体积比3∶97，pH2.7）［12］和0.1 mol/L（pH4.8）醋酸水溶液［6］作流动相烟草样品液中MH的分离情况，结果如图3所示。由此可见，前3种流动相，MH的峰均不能与杂质峰基线分离，0.1 mol/L醋酸水溶液作流动相可以使MH峰和杂质峰达到基线有效分离，可以准确定性定量；因此，选择0.1 mol/L醋酸水溶液作流动相。

2.4 工作曲线、检出限、定量限、回收率和重复性

准确称取0.0100 g MH标准品，置于100 mL容量瓶中，用超纯水溶解、定容，得100 μg/mL MH标准储备液；移取0.01，0.02，0.05，0.1，0.5，1.0，4.0和8.0 mL MH标准储备液，分别置于10 mL容量瓶中，用超纯水稀释定容，得0.1，0.2，0.5，1.0，5.0，10.0，40.0和80.0 μg/mL浓度的MH标准工作溶液，按浓度由低至高的顺序分别对MH标准工作溶液进行HPLC分析，并以MH的峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线的线性方程为Y=20.128X-0.07，相关系数1.000。以3倍信噪比计算检出限，10倍信噪比计算定量限，则方法的检出限为0.33 μg/g，定量限为1.0 μg/g。

在不含MH的样品中分别加入8，80和160 μg/g 3个浓度水平MH标准样品，每个水平加标6次，而后采用本方法测定其MH含量，并根据MH加标量和测定量计算其回收率，结果见表2。由此可以看出，在不同添加浓度下MH的回收率在96.64%～98.02%之间，RSD在5.16%～9.35%之间，说明本方法的准确性较高，重复性较好，可以满足农药残留分析的要求［13］。

图2 烟草样品处理液5根柱子的分离色谱图

表2 不同浓度MH加标回收率和重复性（n=6）

图3 烟草样品处理液4种流动相的MH分离色谱图

2.5 与国标方法测定结果比较

采用本方法和GB/T 19611—2004规定的紫外分光光度法测定了2007年烟草农残普查中检出MH的23个样品中的MH残留量，结果见表3。对表3中数据作配对t检验，在置信水平95%时，显著性水平为0.05，概率P＝0.000，小于0.05，拒绝零假设，可以认为本法测定的结果与国标法测定结果较为一致，二者不存在显著性差异。相对于国标法，本法测定更快，前处理更简单，每人每天能分析15～20个样品，约为国标法日处理量的3倍，提高了工作效率。

3 结论

采用加热回流萃取、固相萃取净化、HPLC法检测烟草及烟草制品中MH残留的方法，测定数据准确，重复性好，每人每天能分析15～20个样品，适用于批量烟草样品中MH残留的快速检测。

表3 本方法与国标法测定的部分烟草样品中MH残留量（μg/g）

［1］王振荣，李布青.农药商品大全［M］.北京：中国商业出版社，1996.

［2］雷永和，李天飞.烟用化肥与农药［M］.昆明：云南科技出版社，1998.

［3］ISO 4876—1980 Tobacco and tobacco products-determination of maleic hydrazide residues［S］.

［4］Yang S S.Determination of maleic hydrazide in tobacco by micellar liquid chromatography［J］.J Chromatogr A，1992，595（1-2）：346-350.

［5］Renaud J M，Keller I，Vuillaume G..Determination of maleic hydrazide residues in cured tobacco by gas chromatography［J］.J Chromatogr A，1992，604（2-3）：243-246.

［6］John Lewis D，Barnes A，Wilkinson K，et al.Extraction of maleichydrazideresiduesfrompotatocrispsandtheir determinationusinghigh-performanceliquidchromatography with UV and atmospheric pressure chemical ionisation mass spectrometric detection［J］.J Chromatogr A，1996，750（1-2）：391-396.

［7］Dias A I，Duncan H J.Residues of free and bound maleic hydrazide in potato tubers［J］.Potato Res，1999，42（1）：89-93.

［8］Kubilius D T，Bushway R J.Determination of maleic hydrazide in potatoes and onions by capillary electrophoresis［J］.J Liq Chromatogr Rel Technol，1999，22（4）：593-601.

［9］Kubilius D T，Bushway R J.Determination of maleic hydrazide in pesticide formulations by capillary electrophoresis［J］.J AOAC Int，1998，81（6）：1109-1111.

［10］Cho R.Rapid analysis of maleic hydrazide in vegetables and fruits using capillary electrophoresis［J］.J Food Hyg Soc Jpn，2000，41（1）：74-78.

［11］裴明黎，蒋振辉，王秋霜，等.马铃薯中马来酰肼的高效液相色谱法测定［J］.分析测试学报，2009，28：611-616.

［12］杨昀，刘玉林.烟叶和土壤中抑芽丹残留分析方法及应用研究［J］.分析化学，2004，32：410-410.

［13］全国农药残留实验研究协作组.农药残留限量实用检测方法手册（第二卷）［M］.北京：化学工业出版社，2001.

［14］GB/T 19611—2004烟草及烟草制品抑芽丹残留量的测定紫外分光光度法［S］.