柑橘和瓯柑橘皮类黄酮清除羟基自由基的效果

张 静

（武夷学院 茶学与生物系，福建 武夷山 354300）

柑橘和瓯柑橘皮类黄酮清除羟基自由基的效果

张 静

（武夷学院 茶学与生物系，福建 武夷山 354300）

以柑橘皮和瓯柑橘皮类黄酮为研究对象,利用Fenton反应产生的羟自由基与染料试剂溴甲酚紫发生氧化反应后使其吸光值降低，间接测定它们对羟自由基（·OH）的清除效果。结果：1mg/mL柑橘皮类黄酮，在0.20～0.80ml的使用剂量范围内，对·OH清除效果呈正比增加趋势（P＜0.01），超过0.80ml后开始略有降低；1mg/mL欧柑橘皮类黄酮,在0.10～1.0ml的使用剂量范围内，对·OH清除效果也呈正比增加趋势（P＜0.01），超过1.0mL后开始下降。同等剂量下瓯柑橘皮类黄酮对·OH清除效果显著高于柑橘皮类黄酮。

溴甲酚紫；羟基自由基；柑橘皮；瓯柑橘皮；类黄酮；硫脲

柑橘皮即陈皮，为传统理气、健脾、燥湿、化痰的中药，具有抗氧化、抗炎症、增强毛细血管韧性，维持血管正常渗透压，降血脂，保护心血管，抗肿瘤等多种功效[1-5]。瓯柑历史上为皇家贡品，原产浙南，为柑桔属的栽培变种，果实金黄鲜艳，清甜多汁，略带苦味，营养价值较高，且耐贮藏，具有祛热生津、化痰、止咳、清凉解毒等功效，《本草纲目》、《本草拾遗》等医书中均有对其药用价值的介绍，《本草纲目》将描述为“利肠胃清热毒、解丹古毒、止暴渴”，民间素有“端午瓯柑似羚羊”之说，并广泛流传欧柑可退烧、治咽喉炎、头痛等热性疾病[6-7]；临床研究证明瓯柑对高血压等症状有一定食疗作用[7-9]。

1 材料与方法

1.1 仪器：紫外分光光度计，可见分光光度计，恒温水浴锅等。

1.2 试剂：

1.2.1 0.05%溴甲酚紫溶液：准确称取溴甲酚紫50.0mg，以95%乙醇溶解定容至100mL。

1.2.2 0.1mol/L盐酸。

1.2.3 1mmol/L FeSO4·7H2O：准确称取27.8mg的硫酸亚铁溶于少量重蒸水中，溶解后移入100mL容量瓶中，定容至100mL。

1.2.4 0.1mol/L H2O2：准确吸取30%的 H2O21.15mL，用重蒸水稀释、定容至100mL。

1.2.5 0.05mol/L NaF：准确称取 210mgNaF，以重蒸水溶解定容至100mL。

1.2.6 0.1mg/m L硫脲：准确称取20.0mg硫脲，以重蒸水溶解定容至200mL，摇匀。

1.2.7 柑橘皮和瓯柑橘皮类黄酮：本实验室从柑橘皮和瓯柑橘皮中提取（提取方法及结果另文报告），使用时用95%的乙醇配成1mg/mL的溶液，过滤后使用。

1.3 羟基自由基(·OH)的产生和测定方法：于10mL比色管中依次加入0.4mL 0.05%溴甲酚紫溶液，0.5mL 0.1mol/L 盐酸，1.0mL 1mmol/L FeSO4·7H2O 溶液；用重蒸水稀释到刻度，摇匀。置于30℃恒温水浴中反应8min，取出后迅速加入0.2mL 0.05mol/L NaF溶液，混匀，终止反应。用1cm比色皿、以水为参比、420nm测定溶液的吸光度，平行测定3次，取平均值作为A0。同法于10mL比色管中分别加入0.4mL 0.05%溴甲酚紫溶 液 ，0.5mL 0.1mol/L 盐 酸 ，1.0mL 1mmol/L FeSO4·7H2O溶液，0.5mL 0.1mol/L H2O2，用重蒸水稀释到刻度，摇匀。置于30℃恒温水浴中反应8min，取出后迅速加入0.2mL 0.05mol/L NaF溶液，混匀，终止反应。同法测定溶液的吸光度，平行测定3次，取平均值作为A，计算吸光度降低△A=A0-A。

1.4 硫脲、柑橘皮和瓯柑橘皮类黄酮清除羟基自由基(·OH)的测定：在1.3体系中分别加入一定量的硫脲、柑橘皮和瓯柑橘皮类黄酮溶液（加在过氧化氢溶液之后），同法测定体系的吸光度，作为As。

1.5 数据统计和处理：计算硫脲、柑橘皮类黄酮、瓯柑橘皮类黄酮实验组对羟基自由基(·OH)的清除率：D=[（As-A ）/(A0-A)]×100% ，结果报告清除率的，组间差异用方差分析，SSR法多重比较。

2 结果：

2.1 A0的测定结果平均值为0.875，A的测定结果平均值为 0.523，△ A=0.352。

2.2 硫脲、柑橘皮和瓯柑橘皮类黄酮对羟基自由基(·OH)清除率的测定结果见表1和图1。

表1：硫脲、柑橘皮和瓯柑橘皮类黄酮对·OH清除率的测定结果（%）

表1：硫脲、柑橘皮和瓯柑橘皮类黄酮对·OH清除率的测定结果（%）

剂量（mL） 柑橘类黄酮与殴柑类黄酮间差异0.128 .41±1.02——18.37±4.12——0.2 32.67±1.42 12.21±0.75 35.98±2.64 P＜0.010 .3 46.87±2.48 17.04±0.40 40.12±2.17 P＜0.010 .4 55.20±1.83 20.03±0.60 43.37±1.74 P＜0.010 .5 60.59±2.19 23.58±2.88 47.81±0.71 P＜0.010 .6 64.28±3.02 27.08±0.43 58.14±5.86 P＜0.010 .758 .71±2.95—— — —0.8——46.59±7.3861 .74±0.59 P＜0.051 .0——44.31±1.7168 .08±1.83 P＜0.011 .2—— —67.47±0.91——处理组0.1mg/mL硫脲1mg/mL柑橘类黄酮1mg/mL瓯柑橘类黄酮

图1 1mg/mL柑橘类黄酮和瓯柑橘类黄酮、0.1mg/mL硫脲不同剂量对·OH的清除率曲线

3 分析与讨论

3.1 羟基自由基(·OH)是活性氧中最活泼的自由基之一，也被认为是毒性最强的活性氧自由基，它比高锰酸钾和重铬酸钾的氧化性还强，羟基自由基(·OH)的氧化电位为2.80V，仅次于氟2.87V。它反应活性大，寿命极短、存在浓度低，几乎可以和所有细胞成分发生反应，对机体危害极大。它是一种非选择性的氧化剂，能很容易的氧化各种有机物和无机物，氧化效率高，反应速度快。在生物体内，需氧代谢的氧化还原反应所产生的羟基自由基(·OH)，可以引发不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，还可以发生抽氢、加成、电子转移等反应，核酸断裂、蛋白质和多糖分解，损伤膜结构及功能，能与氨基酸、蛋白质、核酸和脂肪等生命物质发生氧化反应，引发组织细胞病变和生物机体损伤，从而加速机体的衰老和导致各种疾病的发生，因此对·OH清除剂的研究越来越受到人们的关注[11-12]。

3.2 丁宗庆等报道，硫脲是羟基自由基（·OH）的清除剂[10]，本实验也证明了硫脲能有效地抑制羟基自由基(·OH)反应。本实验中利用Fenton反应产生的羟基自由基(·OH)，在一定条件下可以氧化溴甲酚紫（BCP），使其溶液颜色变浅。当有羟基自由基清除剂存在时BCP颜色变浅的程度减小，减小的程度与羟基自由基(·OH)浓度在一定范围内呈线性关系，此时溶液的吸光度可用来检测羟自由基的清除情况，从而评价实验样品的清除羟自由基的能力。

由表1和图1可见：

（1）硫脲对羟基自由基(·OH)的清除效果：0.1mg/mL硫脲的剂量从0.1增加到0.2mL，对·OH清除率只稍增加，从0.2增加到0.6mL时清除率均显著增加（P＜0.01），0.6mL时清除率达到最高，量效间基本呈正比关系（r=0.9657），剂量超过0.6mL后清除率开始下降；与张德莉等使用1.0mmol/L硫脲0.5～2.0mL，对·OH的清除率从21.44%增加到36.89%，2mL后，清除率不再增加[13]；与本文的试验结果相似。

（2）柑橘皮和瓯柑橘皮类黄酮对羟基自由基(·OH)的清除效果：1mg/mL柑橘皮类黄酮对·OH清除效果和1mg/mL瓯柑橘皮类黄酮对·OH清除效果与硫脲对·OH清除效果相似。1mg/mL柑橘皮类黄酮的剂量从0.2mL增加到0.8mL对·OH清除效果呈正比增加（P＜0.01），0.8mL 时清除率达到最大，剂量超过 0.8mL后清除率开始下降。1mg/mL欧柑橘皮类黄酮的剂量从0.1mL增加到1.0mL对·OH清除效果呈正比增加（P＜0.01），1.0mL 时清除率达到最大，剂量超过 1.0mL后清除率开始下降。从图1上可以明显看出瓯柑橘皮类 黄 酮 0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL剂量对·OH清除效果均高于柑橘皮类黄酮（P＜0.01或0.05）。另外，由于柑橘皮类黄酮对·OH清除效果的清除效果较弱，当剂量为0.1mL时，无法测定到该低剂量下的清除率。

3.3 橙皮甙是柑桔素7-O-芸香糖苷，又名陈皮甙，桔皮甙，是黄酮类化合物的一种,属于植物次生代谢产物，是柑橘果皮中的主要功能成分[2]。橙皮甙可螯合金属离子而抑制自由基引发剂的产生，同时对自由基有直接的清除作用，橙皮甙能与金属离子螯合是其抗氧化的主要依据[14]。秦德安等研究表明橙皮苷有清除·OH的作用和抗膜脂过氧化作用，对·OH引发的红细胞膜损伤具有保护作用，陈皮提取液对·OH的清除作用及对膜脂过氧化的阻抑作用可能与其中橙皮苷有关[5，15]。李琴山等采用一次性密度梯度超速离心方法分离血清HDL，Cu2+诱导HDL氧化，检测反应体系中的丙二醛，观察橙皮甙对HDL氧化的抑制作用，结果发现橙皮甙在体外对Cu2+诱导的HDL氧化有明显的抑制作用，且呈剂量依赖关系，并依此推断：橙皮甙体外抗HDL的氧化作用是其抗动脉粥样硬化的机制之一[16]。

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Scavenging Effect on Hydroxyl Radical by Flavonoids from Citrus Suavissima Peel and Orange Peel

ZHANG Jing

(Tea Science&Biology Department ofWuyiUniversity,Wuyishan，Fujian 354300)

Flavonoids extracted from orange peel and citrus suavissima peel was applied as the object in this study.A method was developed for determination of the hydroxyl radical in Fenton reaction.Bromocresol purple reacted with·OH,then the absorbency of the solution declined.It can be used to determine the·OH indirectly due to the change of absorbency.The results showed that 1mg/mL flavonoids from orange peel increased from 0.2mL to 0.8mL,1mg/mL flavonoids citrus suavissima peel from increased from 0.1mL to 1.0mL on the scavenging effectof·OH is proportional to the increased (P<0.01),and are respectively in 0.8mL and 1.0mL on the removal rate reaches a maximum,and then began to decline.The scavenging effect of·OH from citrus suavissima peel was significantly higher than that from orange peel in the same dose.

brom ocresol purple；OH ；peel of orange；peel of citrus suavissima；flavonoids；thiourea

R285.5

A

1674－2109(2011)05－0036－04

2011-09-22

福建省教育厅《欧柑橘类黄酮提取及药理作用研究》课题内容（项目编号：JA08247）。

张静(1982-)，女，汉族，硕士，助理工程师，主要研究方向：食品安全及生物化学。