橄榄酚类提取物的抗氧化性能*

冯英委，何志勇，陈洁，曾茂茂，秦昉，陶冠军，王林祥

(江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡，214122)

橄榄(Canarium albumL．Rauesch)，又名青果、白榄、黄榄、山榄。我国橄榄品种资源丰富，其与原产欧洲地中海地区的油橄榄(OleaeuropaeaL．)实为不同科属的植物［1］。橄榄具有很高的食用药用价值，属卫生部批准的既是食品又是药物的69种物品之一，具有解酒护肝、抗菌消炎、抗病毒、解毒、抑制血糖升高和增加骨密度与骨钙含量等药理功效，酚类化合物是其主要药效成分［2］。

酚类化合物由于其分子含有酚羟基结构，具有较强的抗氧化作用，不仅有益于人体健康，而且对于食品的抗氧化也具有潜在的积极作用。随着工业化社会的发展，在崇尚绿色天然的消费观念下，人们越发对天然提取物产生兴趣。从天然产物中提取酚类化合物并开发应用于食品、制药、生化、日化、精细化工、营养、功能高分子材料等领域的研究已成为当前热点［3］。我国橄榄酚类物质的开发利用尚处于起步阶段，目前有关橄榄酚类物质功能活性的研究报道较少，其抗氧化活性的评价方法体系还比较单一。本研究通过测试还原力、金属离子螯合能力及4种不同自由基清除能力，以考察橄榄酚类提取物的抗氧化性能。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

福建檀香橄榄:无锡朝阳果蔬批发市场采购;橄榄酚类提取物:新鲜橄榄去核，果肉打浆，再用体积分数70%的乙醇溶液搅拌提取，提取液经真空浓缩、冷冻干燥得到粗提物产品;橄榄酚类纯化物:橄榄酚类粗提物用水溶解后上AB-8大孔树脂纯化，洗脱液经真空浓缩、冷冻干燥即得橄榄酚类纯化物产品;2，2＇-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、1，1-二苯-2-苦基苯肼 (DPPH)、Fe3+-三吡啶三吖嗪(TPTZ)、3-(2-吡啶基)-5，6-双(4-苯磺酸)-1，2，4-三嗪(Ferrozine)、6-羟基-2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸(Trolox)、丁基羟基茴香醚(BHA)、Vc、没食子酸，均为美国Sigma公司产品;其他试剂为国产分析纯。

UV-2800H型紫外可见分光光度计，上海仪器有限公司;TGL-16G台式离心机，上海安亭科学仪器厂;Lab Dancer圆周振荡器，广州仪科实验室技术有限公司;pH计，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理

分别称取3 g橄榄酚类粗提物和1 g橄榄酚类纯化物，以体积分数为70%的乙醇溶解并定容于100 mL的容量瓶中，各超声10 min，离心取上清液备用。

1.2.2 样品总酚含量的测定

精确吸取样品液1 mL与Folin-Ciocalteu试剂2.5 mL于10 mL容量瓶，振摇混匀后放置5 min，加入碳酸钠溶液(75 g/L)2 mL，用超纯水定容后混匀。30℃下反应2 h，于760 nm波长处测定吸光值，以超纯水作为空白对照。以没食子酸配制成10～50 mg/mL的系列标准溶液，作标准曲线。样品的总酚含量表示为与每毫升样品溶液相当的没食子酸(gallic acid equivalent，GAE)的毫克数(mg GAE/mL)［4］。

1.2.3 ABTS自由基(ABTS+·)清除能力的测定

工作液制备:用超纯水将ABTS和高硫酸钾分别溶解并混合，使其浓度分别为7 mmol/L和2.45 mmol/L，在室温、避光条件下放置 12～16 h，形成ABTS自由基储备液，使用前用磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L，pH 7.4)稀释，使其 734 nm处吸光度为(0.700±0.020)。

测定方法:将橄榄酚类粗提物和纯化物分别稀释成不同浓度(0.01、0.02、0.03、0.05 和 0.1 mg/mL)，以BHA和Vc作为阳性对照。精确吸取样品稀释液0.1mL，加入3.9mL ABTS工作液充分混合，在30℃反应10 min后，于734 nm波长处测定吸光值得A1，以超纯水作空白得A0，计算ABTS自由基清除率。以0～1 000μmol/L的Trolox标准溶液绘制标准曲线，样品的ABTS自由基清除能力用TEAC值(trolox equivalent antioxidant capacity)表示［5］。

1.2.4 DPPH自由基(DPPH·)清除能力的测定

试剂配制:用无水乙醇溶解9.858 mgDPPH并定容至25 mL的棕色容量瓶，配置成1 mmol/L的溶液，冷藏放置。用无水乙醇稀释10倍使用。

测定方法:将橄榄酚类粗提物和纯化物分别稀释成不同浓度(0.001、0.005、0.01、0.02 和 0.1 mg/mL)，以BHA和Vc作为阳性对照。将2 mL超纯水和2 mL样品液分别加入等体积DPPH溶液(0.1 mmol/L)，振荡混合，30℃条件下反应30 min后在517nm测定吸光值，得到A0和A1。A2由2 mL样品液加入等体积无水乙醇测定，计算DPPH自由基清除率。以0～40μmol/L的trolox标准溶液绘制标准曲线，样品的 DPPH自由基清除能力用 TEAC值表示［6］。

DPPH·清除率/%=［1－(A1－A2)/A0］×100

1.2.5 羟自由基(·OH)清除能力测定

采用氧化邻二氮菲-Fe2+法［7］，将橄榄酚类粗提物和纯化物分别稀释成不同浓度(0.01、0.02、0.05、0.1和0.2 mg/mL)，以BHA和Vc作为阳性对照。取5 mmol/L邻二氮菲1.0 mL加入试管，再加入0.2 mol/L、pH 7.4的磷酸盐缓冲液2.0 mL和样品溶液1.0 mL，充分混匀。再加入7.5 mmol/L的FeSO4溶液1.0 mL，并立即混匀。再加入0.1%H2O21.0 mL，混匀后37℃保温1 h，于536 nm处测其吸光值A1，用同体积的超纯水代替样品液得空白对照A0。

试剂配制:称取 0.1261 g邻苯三酚，溶于10 mmol/L的HCl溶液，并以10 mmol/L的HCl定容到100 mL混匀，得到10 mmol/L的邻苯三酚溶液。

测定方法:将橄榄酚类粗提物和纯化物分别稀释成不同浓度(0.05、0.1、0.2、0.5 和 1 mg/mL)，以BHA和Vc作为阳性对照。参照文献［6］方法略改进，取0.1 mL样品，加入1.8 mL的Tris-HCl缓冲液(pH 8.2、50 mmol/L)，再加入 2 mL 超纯水，混匀后在25℃水浴中保温10 min，再加入0.1 mL的邻苯三酚溶液(10 mmol/L)，立即混匀，于320 nm下测定吸光值。从加入邻苯三酚后30 s开始读数，以后每隔30 s读数一次，直到第4 min结束。以时间和吸光值分别为横、纵坐标作图，得到的曲线斜率计为△A1，以超纯水为空白对照，得到的斜率计为△A0。

1.2.7 铁离子还原能力的测定(FRAP)

试剂配制:10 mmol/L的 TPTZ储备液(用40 mmol/L的盐酸溶解)，20 mmol/L的 FeCl3溶液和0.3mol/L的醋酸缓冲液(pH 3.6)以体积比1∶1∶10混合，并在37℃下静置1 h得FRAP工作液。

测定方法:将橄榄酚类粗提物和纯化物分别稀释成不同浓度(0.01、0.02、0.05、0.1 和 0.2 mg/mL)，以BHA和Vc作为阳性对照。精确吸取样品稀释液100 μL，加入 300 μL 超纯水和 3 mL 新鲜配制的FRAP工作液，充分混合，在37℃反应30 min后，于593 nm处测定吸光值，以超纯水作为空白对照。以0～600 μmol/L的Trolox标准溶液绘制标准曲线。样品的还原能力(FRAP值)以TEAC值表示［8］。

1.2.8 亚铁离子螯合能力的测定

将橄榄酚类粗提物和纯化物分别稀释成不同浓度(0.01、0.02、0.05、0.1 和 0.2 mg/mL)，以 BHA 和Vc作为阳性对照。参照文献［9］方法有所改进，1 mL样品溶液与0.05 mL的FeCl2溶液(2 mmol/L)、1.85 mL超纯水混合。加入0.1 mL的ferrozine(5 mmol/L)溶液，并均匀混合。30℃条件下保温10 min，在562 nm下测定吸光值A1。以超纯水为空白对照得A0。计算螯合率。

2 结果与讨论

2.1 橄榄提取物中总酚含量

经Folin-Ciocalteu法测定，橄榄粗提物粉末中总酚含量为15.4%，纯化物粉末中总多酚含量为49.7%。

2.2 橄榄酚类提取物ABTS+·清除能力

图1 橄榄酚类提取物的ABTS+·清除能力

如图1所示，橄榄酚类粗提物、纯化物，BHA和Vc清除ABTS+·的能力均随样品浓度增大而增强，橄榄酚类粗提物和纯化物ABTS+·清除能力在相同浓度下差别不大(P＞0.05)。在0.01～0.05 mg/mL内，橄榄酚类粗提物和纯化物的剂量-效应关系增加很明显，而在0.05～0.1 mg/mL内清除能力增加比较平缓，在0.1 mg/mL时，其TEAC值分别为957.9 μmol/L(清除率为99.7%)和 959.4 μmol/L(清除率为99.8%)。在各浓度下，粗提物和纯化物ABTS+·清除能力均显著强于 BHA和 Vc(P＜0.05)。且BHA、Vc在0.1 mg/mL时其 TEAC值才分别达到754.8μmol/L(清除率为 79.5%) 和 391.6 μmol/L(清除率为43.5%)。由此显示，橄榄酚类物质具有很强的ABTS+·清除能力。

2.3 橄榄酚类提取物DPPH·清除能力

由图2可知，在0.001～0.02 mg/mL内，各样品清除DPPH·的能力随浓度增大而增强，且剂量－效应现象非常明显，清除能力从强到弱依次为橄榄酚类纯化物，粗提物，Vc，BHA(P＜0.05)。在0.02 mg/mL时，粗提物、纯化物和Vc清除DPPH·的TEAC值均接近最大值40μmol/L(清除率为95.5%)，之后清除能力变化较小。而BHA清除DPPH·能力相对较弱，在0.02 mg/mL时其 TEAC值为33.3μmol/L(清除率为79.7%)。由此可见，橄榄酚类提取物具有较强的DPPH·清除能力，且粗提物和纯化物在相同浓度条件下·OH清除能力相当(P＞0.05)。

图2 橄榄酚类提取物的DPPH·清除能力

2.4 橄榄酚类提取物·OH清除能力

从图3可发现，在测试浓度范围内，橄榄酚类粗提物、纯化物，BHA清除·OH的能力随样品浓度增大而逐渐增强，清除率从30%左右增加到最大的50%左右。而Vc的·OH清除能力则明显很弱，其清除率均在6%以下。浓度在0.05 mg/mL以下时，橄榄酚类提取物的·OH清除能力与BHA无显著性差异(P＞0.05)，但在0.1 mg/mL以上时，提取物·OH清除率要高于BHA。说明橄榄酚类提取物具有一定的·OH清除能力。另外，橄榄酚类粗提物和纯化物在相同浓度条件下其·OH清除能力相差不大(P＞0.05)。

图3 橄榄酚类提取物的·OH清除能力

2.5 橄榄酚类提取物清除能力

图4 橄榄酚类提取物的清除能力

2.6 橄榄酚类提取物铁离子还原能力

如图5所示，在试验浓度内，橄榄酚类粗提物、纯化物和BHA的铁离子还原能力均随样品浓度增大而明显增加(P＜0.05)，在0.2 mg/mL时，酚类提取物的FRAP值达1 700μmol/L Trolox以上，而Vc的铁离子还原能力则相对较弱(700μmol/L Trolox)。在相同浓度条件下，橄榄酚类提取物的铁离子还原能力要强于BHA和Vc，说明橄榄酚类提取物具有较强的还原能力，其总抗氧化活性较强。另外，橄榄酚类粗提物和纯化物的铁离子还原力差异较小(P＞0.05)。

图5 橄榄酚类提取物的铁离子还原能力

2.7 橄榄酚类提取物金属离子螯合能力

橄榄酚类提取物和Vc的亚铁离子螯合能力均较弱，BHA在试验浓度范围内显示无亚铁离子螯合能力(见图6)。酚类纯化物金属离子螯合能力随样品浓度增大而有所增强(P＜0.05)，其浓度在0.2 mg/mL时，螯合率为14.9%。Vc的金属离子螯合率最高为15.8%，随浓度增大其螯合率减小并维持在5%左右的水平。而橄榄酚类粗提物的亚铁离子螯合率均在4%以下，明显低于橄榄酚类纯化物(P＜0.05)，这可能是由于不同纯度的酚类提取物中酚类化合物组成不同所致。

图6 橄榄酚类提取物的金属离子螯合能力

3 结论

对橄榄酚类提取物进行不同的抗氧化体系检测，结果表明，橄榄酚类提取物具有比BHA和Vc更强的ABTS+·、DPPH·和·OH清除能力及铁离子还原力，橄榄酚类提取物同时具有较好的O2－·清除能力，虽不及Vc，但强于BHA，而其亚铁离子螯合能力较弱。橄榄酚类粗提物和纯化物相同浓度下在ABTS+·、DPPH·、·OH清除能力和铁离子还原能力方面相差不大(P＞0.05)，而在O2－·清除能力和亚铁离子螯合能力方面表现有所差异，纯化物亚铁离子螯合能力要强于粗提物，其O2－·清除能力要弱于粗提物。综合而言，橄榄酚类提取物显示具有较好的抗氧化性能，可作为天然抗氧化剂进一步开发利用。

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