APOB rs515135位点多态性在北方汉族人群中的分布及与血脂水平相关性研究

于霞，谭晓华，王保东，王小波，林建潮，李金涛，杨磊．

（1新疆地方与民族高发病省部共建教育部重点实验室，石河子832002；2杭州师范大学医药卫生管理学院，杭州310036）

高脂血症（hyperlipidemia，HL）是冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）、脑梗死、心肌梗死等疾病的重要危险因素。高脂血症发病受遗传、环境和生活方式等多因素影响。在遗传因素的影响方面，现有研究发现多个基因与血脂水平相关，由多个易感基因的多个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）微效作用共同作用而发病，其中载脂蛋白（apoprotein，APO）是构成血浆脂蛋白的主要成分在血浆脂类的转运和代谢中起决定性作用的蛋白质。研究证实多种APO基因的多个位点的变异均对血脂水平有一定的影响，但在不同人群的研究结果不尽相同。APOB作为低密度脂蛋白的构成成分，在脂类转运和代谢过程中起着极其重要的作用。APOB基因的多个位点与血脂异常相关。受制于研究手段通量的限制，早期SNP多采用RFLP等手段对一个或少数几个位点进行检测分析，近年来由于技术进步，使得全基因组关联研究（Genome－wide association study，GWAS）方法在疾病易感基因SNP筛选方面得以应用，通过GWAS方法，科学家已经筛选出了一批疾病的易感基因。

在高脂血症遗传位点研究方面，有2个独立的研究均发现APOB的染色515135位点A等位基因与低密度脂蛋白胆固醇（LDL－C）降低显著相关［1－2］。Willer等［1］采用GWAS在比较了冠状动脉疾病（coronary artery disease，CAD）与对照的样本中SNPs差异，发现了11个与LDL相关的位点，其中rs515135位点在G等位基因的频率为83%，增加了LDL水平6．08mg／dL。Kathiresan［2］在一项血脂水平相关SNP位点研究中，发现了30个与血浆脂蛋白水平相关的位点，其中rs515135G等位基因频率为80%，A等位基因与低LDL－C水平相关。除了上述2篇文献外，尚未见到该位点研究的报道。

以上2项研究均以西方人群为研究对象，在中国汉族人群的分布频率及其与血脂水平的相关性尚不清楚。因此，本研究采用MALDI－TOF MS方法检测rs515135位点在人群中的分布情况，统计分析其与血脂水平的关系，为中国汉族人群高脂血症的预防及个体化诊疗提供依据。

1 材料与方法

1．1 研究对象

选择北京市某社区常住汉族居民作为研究对象，个体均无血缘关系，采用自填式调查问卷对社区居民进行调查。根据中国成人血脂异常防治指南制订联合委员会制定的“中国成人血脂异常防治指南”中的诊断标准［3］，即甘油三脂（TG）≥2．26mmol／L和（或）总胆固醇（TC）≥6．22mmol／L，确诊高脂血症组和正常对照组。各型高脂血症诊断标准为：

（1）高胆固醇血症：TC≥6．22mmol／L，TG＜2．26mmol／L。

（2）高甘油三酯血症：TG ≥2．26mmol／L，TC＜6．22mmol／L。

（3）混合型高脂血症：TC ≥6．22mmol／L，TG≧2．26mmol／L。

（4）低高密度脂蛋白血症：HDL＜1．04mmol／L。其中病例组540例，平均51．10±15．30岁；正常对照组261名，平均52．33±13．01岁，排除肝、肾、甲状腺病变和糖尿病等。两组在性别、年龄等方面无显著性差异，具有可比性。

1．2 方法

1．2．1 血样采集及血脂测定 获得调查对象的知情同意后，采集空腹12h外周静脉血4mL，EDTA抗凝，血样于2h内离心分离收集血浆和血细胞。检测的血脂指标包括空腹血清总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL－C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL－C）、甘油三酯（TG）等。TC、TG采用酶法测定，HDL－C、LDL－C采用直接法测定。

1．2．2 DNA提取 用酚氯仿法提取外周血白细胞DNA；用分光光度法测定DNA浓度，并稀释DNA浓度至10～30ng／μL，用作PCR扩增模板。

1．2．3 引物的设计与合成 采用MassARRAY设计软件设计PCR扩增引物和延伸引物。

表1 rs515135的引物序列（5’－3’）Tab．1Primer sequences of rs515135（5’－3’）

1．2．4 SNP基因型分析 采用 MALDI－TOF质谱技术和Spectrochip芯片技术对ApoB基因rs515135位点进行分型检测，所有试剂由MassARRAY生产仪器试剂公司（美国Sequenom公司）提供。基本原理为：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 （MALDI－TOF MS）基因分型技术，即PCR扩增后的产物，加入SNP序列特异延伸引物，在SNP位点上，延伸1个碱基，然后根据延伸产物分子质量的不同而确定其基因型。

反应体系为5μL，其中10×PCR buffer 0．5 μL，25mmmol／L MgCl20．4 μL，25mmmol／L dNTP Mix 0．1μL，0．5μmmol／L Primer Mix 1 μL，5U／μL Taq 酶 0．2μL，模板 DNA 1μL，ddH2O 1．8μL。反应条件：94℃预变性4min，94℃变性20s，56℃退火30s，72℃延伸1min，热循环45次；最后72℃延伸3min。碱性磷酸酶处理去除PCR反应后剩余的dNTP，然后进行单碱基延伸反应，其中10×iPlex buffer plus 0．2μL，iPlex terminator 0．2μL，primer mix 0．94μL，iPlex Enzyme 0．041μL，ddH2O 0．619μL。反应条件：94℃预变性30s，94℃变性5s，52℃退火5s，80℃延伸5s，热循环40次；最后72℃延伸3min，应用MassARRAY iPLEXTM基因变异技术，采用 MALDI－TOF质谱技术和spectrochip芯片技术对rs515135位点进行基因型分析。

1．2．5 统计学处理 实验数据以¯X±S表示，计量资料比较采用单因素方差分析；SNP各基因型在不同血脂人群中的分布比较采用R×C表χ2检验，并判定各SNP等位基因频率分布是否符合Hardy－Weinberg平衡。

2 结果

2．1 研究人群的一般情况

共收集到540例高脂血症患者样本，正常对照组261例。高胆固醇血症病例259例，高甘油三酯血症病例281例，混合型高脂血症病例94例，低高密度脂蛋白血症病例299例。研究人群的一般情况见表2，HL病例组的TC、TG、LDL－C显著高于对照组，而 HDL－C显著低于对照组（P≤0．01），年龄、性别比例无差异（P＞0．05），具有可比性。

表2 高脂血症组和对照组的各指标的比较Tab．2comparison of the various indicators in hyperlipidemia group and normal group

2．2 APOB rs515135位点的多态性在病例组与对照组中的分布比较

rs515135位点3种基因型（GG、GA、AA）在病例组的分布频率分别是83．0%、16．5%、0．6%，在对照组中的分布频率分别是76．6%、21．8%、1．5%，rs515135位点的基因型频率分布在病例组和对照组间无显著性差异（P＞0．05），见表3。等位基因G、A在病例组和对照组中分布频率分别为91．2%、8．8%和87．5%、12．5%，A 等位基因在病例组与对照组间的分布频率有统计学差异（P＜0．05），OR 值为 0．678。Hardy－weinberg 平衡检验：自由度＝2，病例组卡方值等于4．67，对照组卡方等于5．99，P 值＞0．05，符合 Hardy－weinberg平衡检验，提示rs515135在人群中均已达到遗传平衡，具有较好的人群代表性。

表3 rs515135的基因型和等位基因在高脂血症组与对照组的分布Tab．3The frequency of the locus rs515135’s genotype and allele in hyperlipidemia group and control group

2．3 APOB rs515135位点的多态性在高脂血症的临床分类中的分布比较

根据血脂异常情况又可以将高脂血症分为高胆固醇血症、高甘油三脂血症、混合型高脂血症和低高密度脂蛋白血症4种类型。由表4可见GG、GA、AA基因型频率在四型高脂血症组和对照组间的差别无统计学意义（P＞0．05）。

表4 APOB rs515135位点在4型高脂血症病例组和正常组中的分布Tab．4The frequency of the locus rs515135in four kinds of hyperlipidemia group and the normal group

3 讨论

APOB基因位于人类第2号染色体短臂的23～24区，是LDL和VLDL中主要的载脂蛋白，对维持体内血脂水平的恒定具有重要作用。APOB基因与其他载脂蛋白的结构相比较有显著的差异，存在多个遗传突变位点，已被认为是促使动脉粥样硬化与冠心病的危险因子［4］。Murray等［5］研究发现LDL水平升高、HDL水平降低及TG水平是心血管疾病重要的独立危险因素，并发现APOB基因rs693位点的A等位基因与LDL及TG水平的升高相关，结果与 Kathiresan等［6］研究结果相符。Willer等［1］研究发现有18个与脂质代谢强相关的位点，还有若干个在脂代谢中曾经研究证实过的位点，同时首次发现了APOB rs515135位点与LDL－C相关（P＜10～13），该位点的C等位基因突变可以引起LDL－C水平的升高，且每一个C等位基因突变可使LDL－C升高6．08mg／dL。

目前，在人类APOB基因已发现200多个多态位点，研究较多的是XbaI、EcorI及信号肽编码区插入／缺失多态性，其中多个位点与血脂水平和心脑血管病相关。而对于APOB rs515135位点单核苷酸多态性的研究在国内还未见报道，且国内多数对于基因多态性位点的研究方法还是限制性酶切片段长度多态性，本研究采用高通量且准确性较高的MALDI－TOF MS方法检测rs515135位点的单核苷酸多态性在国内尚属首次报道。在本研究结果中rs515135位点的A等位基因在北方汉族人群中分布频率为8．8%，低于西方报道的最小等位基因频率20%，并且在病例及对照组中的分布有统计学差异（P＜0．05），OR值为0．678，说明 A等位基因可能是高脂血症的保护性因素，这是在中国汉族人群中首次明确该位点的分布情况。

综上所述，在本研究中APOB rs515135的基因型频率在高脂血症组和正常组的分布无差异，其中A等位基因与高脂血症密切相关，是高脂血症的保护性因素。但有研究证明该位点的基因多态性与血脂代谢密切相关，仍需进一步证实。

［1］Willer C J，Sanna S，Jackson A U，et al．Newly identified loci that influence lipid concentrations and risk of coronary artery disease［J］．Nat Genet，2008，40（2）：161－169．

［2］Kathiresan S，Willer C J，Peloso G M，et al．Common variants at 30loci contribute to polygenic dyslipidemia［J］．Nat Genet，2009，41（1）：56－65．

［3］中国成人血脂异常防治指南制订联合委员会．中国成人血脂异常防治指南［J］．中华心血管病杂志，2007，35（5）：390－419．

［4］Machado M O，Hirata M H，Bertolami M C，et al．ApoB genehaplo type is associated with lipid profile of higher risk forcoronary heart disease in Caucasian Brazilian men［J］．J Clin LabAnal，2001，15（1）：19－24．

［5］Murray A，Cluett Ch，Bandinell S，et al．Common lipidaltering gene variants areassociated with therapeutic interventionthresholds of lipid levels in older people［J］．European Heart Journal，2009，30（14）：1711－1719．

［6］Kathiresan S，Melander O，Guiducci C，et al．Six new loci associated with blood low－density lipoprotein cholestero，high－density lipoprotein cholesterol or triglycerides in humans［J］．Nat Genet，2008，40（1）：189－197．