siRNA介导小鼠Zfy基因干扰的定量分析

彭强，班谦，贾斌，李洪涛

（石河子大学动物科技学院，石河子832003）

Zfy基因是睾丸决定因子（testis－determining facter，TDF）的候选基因［1］，其编码的锌指蛋白与核酸结合有关，在早期胚胎性别决定中起着重要作用［2－3］。Zfy基因位于 Y 染色体短臂（Yp11．3）上，有11个外显子和1个随机重复区域的13个“锌－指”结构［4］，有约801个氨基酸，30个氨基酸残基，由2个半胱氨酸和2个组氨酸配位1个锌离子构成［5］。其具有2个核定位信号区和DNA结合位点，能够特异性的与靶基因结合，引导靶基因穿过核膜，定位于精子细胞核内，其编码蛋白可能作为转录因子，在精子形成过程中具有一定功能［6］，与精子的发生有关［7］。Zfy基因是继SRY基因之后的又一睾丸决定因子。

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种转录后水平的基因沉默 （post－transcriptional gene Silencing，PTGS）现象，能够高效、特异的阻断体内特定基因的表达，引起转录后同源mRNA的降解［8］。该现象的发现及其在生物学上的应用具有划时代的意义，其快速、简洁、特异性强的优点，使其一出现就受到科研工作者的青睐。目前关于RNAi的作用原理已经初步认清［9－10］，且有机体可以利用RNAi来抵御病毒及其它外来核酸的侵入［11］。RNAi可成为基因功能分析和基因治疗的一种有效工具，用来抑制特定基因的表达。

RNAi技术的出现和迅速发展为我们探究Zfy基因的功能提供了新手段。本研究根据Zfy基因的特点，构建了2个以小鼠Zfy基因为靶点的siRNA干 涉 载 体 pSilencer5．1／Zfy225 及 pSilencer5．1／Zfy2122，

利用RNAi方法干扰生精过程中Zfy基因的表达，达到限制甚至损害Y精子的结构或功能发育，再进行受精，进而达到人为影响后代性别的目的，同时也为研究性别控制提供了一个新的思路。

1 材料与方法

1．1 材料

选取8周龄健康的雄性昆明小白鼠32只，购自石河子大学实验动物中心。实验所用的小鼠均饲养在定期灭菌的控温鼠房，自由采食和饮水。经检测所有试验小鼠的繁殖性能良好。

1．2 方法

1．2．1 Zfy基因RNAi重组载体构建与体外验证

设计Zfy基因的RNAi靶序列，通过BLAST分析以及siRNA相关设计原则［12］，筛选出了2条siRNA。分别在5′和3′端引入限制性内切酶BamHI和HindIII的酶切位点，合成发夹状RNA（short hairpin RNA，shRNA）寡核苷酸链及其互补链（表1）。

分别将Zfy225与Zfy2122的上下游合链，再连入经BamHI和HindIII（TaKaRa公司）双酶切的pSilencer5．1－H1Retro载体（Ambion上海吉泰生物工程有限公司），构建成siRNA表达载体pSilencer5．1／Zfy 225（简称p225），pSilencer5．1／Zfy2122（简称p2122），并转化到E．coli Top 10感受态细胞（北京天根生化有限公司）中，用质粒DNA提取试剂盒（北京天根生化有限公司）按说明书操作提取质粒，经EcoR I和Hind III双酶切鉴定重组质粒后，送生物技术有限公司测序。

经体外细胞水平上的验证表明，siRNA表达载体介导的RNAi技术，能特异性抑制小鼠生精细胞中Zfy基因的表达。

表1 shRNA寡核苷酸序列Tab．1The oligo sequence for shRNA template

1．2．2 Zfy基因体内RNAi试验

1．2．2．1 Zfy基因RNAi片段的导入

通过前期试验摸索体内RNA干扰的最佳条件，确定采用睾丸局部注射质粒40mg／次导入小鼠体内。将32只雄鼠随机分成4组（每组8只），试验I组、II组分别注射重组质粒p225与p2122，阴性对照组注射空载体pSilencer5．1－H1Retro作为对照组。空白对照组注射同等体积的生理盐水。间隔10d注射1次，连续注射4次，最后1次注射17d后，将各组的雄鼠处死，迅速取出睾丸组织放入液氮速冻保存。

1．2．2．2 qRT－PCR测定睾丸Zfy基因 mRNA 丰度检测

采用 Trizol（美国Invitrogen）法提取睾丸RNA，进行反转录。反转录总反应体积为20μL，体系为：2μg总 RNA、0．5mmol／L dNTP 和 5 μmol随机引物，在75℃下变性5min，随后立即置冰上冷却，再加入20URNA酶抑制剂（RNase inhibitor）、10U 反转录酶（AMV RTase）、4．0μL 5×RT Buffer，42℃反应60min，最后在95℃下变性5 min。利用荧光实时定量（stratagene，MX3000P）PCR方法检测Zfy基因的mRNA表达水平，所用引物信息见表2。

PCR反应体系的总体积为25．0μL，其中含12．5μL SYBR＠ Premix Ex TaqTM（2×）（大连宝生物），上下游引物（10．0μmol／L ）各0．5μL，2．0 μL cDNA模板，加ddH2O至终体积。反应程序为：95℃ 预变性30s，95℃变性5s，退火15s（退火温度见表2），72℃延伸15s，40个循环。试验对所有样本进行3个重复测定，并在每次试验时设阴性对照。将克隆有目的片断的质粒进行梯度稀释后作为标准品，制作标准曲线。

表2 目的基因引物序列及PCR条件Tab．2Conditions of PCR and parameters of oligonucleotide primer pair

1．3 数据统计

采用相对定量解析的双标准曲线法，以Gapdh为内标基因进行标准化，统计分析定量检测结果。所得数据利用SPSS 13．0统计软件，均为平均数±标准误（¯χ±SE），单因子方差分析（one－way ANOVA，LSD）检验实验结果的差异显著性，并进行多重比较。

2 结果与分析

利用qRT－PCR检测经RNAi后试验组与注射生理盐水与空载体的对照组Zfy mRNA的表达水平。结果显示：注射重组载体p2122，Zfy基因mRNA表达水平极显著低于对照组（P＜0．01）；注射重组载体p225，Zfy基因mRNA表达水平显著低于对照组（P＜0．05）。重组载体p2122组与p225组之间差异显著（P＜0．05）（图1）。

图1 Zfy基因mRNA表达情况Fig．1The mRNA expression level of Zfy gene

3 讨论

Vergnaud等［13］发现并克隆了Zfy基因，Page等［14］明确指出Zfy基因与性别分化、精子发生有关，在X染色体上存在其同源序列Zfx。Zfy基因是Y染色体短臂上特异性单拷贝序列，一直以来人们针对Zfy／Zfy基因的特异性进行性别鉴定［15－16］。王晗等［17］根据小鼠的Zfy／Zfy 基因设计PCR引物，将2－细胞、4－细胞、8－细胞和16细胞胚胎采用微量细胞样品经PCR扩增，鉴定胚胎的性别，经核型分析表明鉴定胚胎的准确率达到95．2%（20／21）。于萍等［18］用巢式 PCR 扩增母体血浆中胎儿游离DNA的Zfy基因，进行产前诊断，准确率为84．8%（39／46）。徐艳春等［19］利用哺乳动物的毛发作为材料提取DNA，扩增Zfy／Zfy基因，随机选取8种动物进行性别鉴定，得到的结果与表型完全一致。另外根据Zfy基因具有高度保守性的特点，毛德才等［20］、金梅等［21］扩增第11外显子并测序，分析物种之间的进化关系。Reynolds等［7］还指出Zfy基因与精子发生相关。本文利用RNAi技术结合RT－PCR的方法探讨小鼠生精过程中Zfy基因的功能，结果可为受精前进行性别控制奠定基础。

目前普遍认为性别决定过程可能是以SRY基因为主导，在胚胎发育的特定阶段，由一系列上游或下游基因参与和协调的级联反应，最终完成雄性性别分化的过程［22－23］。赵 金 红 等［24］利 用 RNAi的 方法抑制雄性胚胎SRY基因的表达，抑制率达到85%。由于SRY基因只能引导雄性性别的分化，即使干扰了SRY基因，胚胎的性别不一定会向着雌性分化，可能会产生性别畸形。因此本文采用RNAi技术干扰与精子发生相关的特异性基因Zfy，在精子形成过程中限制或损坏Y精子的功能发育，使更多的X精子获得受精的机会，从而产生雌性后代。

Zinmemann等［25］将载脂蛋白基因的siRNAs包裹入微脂胶囊中，通过单注射导入猕猴体内，RNAi效果持续了11d。据报道小鼠的生精上皮周期是8．6d［26］，他们将再发育成具有受精能力的精子，需要约8d，即从精原干细胞开始分化到精子完全成熟需要16．6d。本研究考虑到siRNAs在体内稳定存在的时间以及精子成熟时间，采取间隔10d注射1次，共注射4次，最后1次注射17d后，即从第1次注射到最后采集睾丸组织，共计47d。从而尽可能保证雄鼠睾丸附睾中的绝大部分精液在Zfy基因干扰过程中产生。本研究的后部分试验正在进行中，将已经干扰Zfy基因的雄鼠与雌鼠交配，观察其后代性别比例，可为研究Zfy基因在小鼠生精过程中的作用及其对动物性别的影响的进一步研究奠定基础。

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