激素对光果甘草愈伤组织总黄酮含量的影响

余茜，赵红艳，马淼

（1石河子大学生命科学学院，石河子832003；2新疆师范大学生命科学学院，乌鲁木齐830054）

甘草是我国传统的中药材，具有益气补中、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和药性等多种功效［1］，素有“药中国老”和“十方九草”之称。黄酮类物质是甘草中最主要的活性成分之一，具有抑菌、降压、保肝、美白、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化等多种药理作用［2］。

由于其在医药、食品、饮料、化妆品、卷烟等行业的广泛用途，日益增长的市场需求以及掠夺式的资源采挖，使我国甘草资源遭受到了严重破坏，野生甘草资源面临枯竭［3］，自然资源难以满足目前日益增长的市场需要。保护和恢复甘草野生资源，提高甘草产量是目前亟待解决的问题之一。通过生物技术手段获得甘草黄酮物质的研究已有报道［4－5］，但多为乌拉尔甘草与胀果甘草，且外植体相对单一，以根、下胚轴及子叶为主。

光果甘草（Glycyrrhiza glabra L）是《中国药典》收录的三种药用甘草之一，也被称为欧甘草，在我国仅零星分布于南北疆，但其黄酮类化合物成分特别，具有很强的皮肤美白效果，对SAS病毒的复制亦有显著的抑制作用。然而，有关光果甘草通过组织培养获得黄酮类化合物的研究还鲜有报道。本文研究了不同激素组合与不同激素水平对光果甘草根、胚轴、子叶、真叶、节、以及节间等6种外植体愈伤组织中总黄酮含量的影响，以期筛选出黄酮高产的最佳外植体和最适培养基激素条件，为光果甘草的进一步研究和高效利用提供实验证据。

1 材料与方法

1．1 材料

光果甘草种子由石河子大学马淼教授鉴别、提供。甲醇、乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯；芦丁标准品购自中国药品生物制品检定所。

可见分光光度计Spectrumlad 22PC（上海棱光技术有限公司）；202型电热恒温干燥箱（北京市永光明医疗仪器厂）；KQ－300E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HH－S恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂）；SHZ－D（Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）；DNP－9162型电热恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）。

1．2 无菌材料的获得

选取健康、饱满的光果甘草种子，98%浓硫酸流处理40min，蒸馏水冲洗种子3～5次。在无菌条件下，用无菌水冲洗甘草种子3次，75%乙醇浸泡20～30s，无菌水冲洗3次，0．1%升汞消毒8min，无菌水冲洗4次，用无菌滤纸吸去种子表面水分，接种于MS培养基。先暗培养，待种子萌发后，转入光下培养，获得无菌苗。

1．3 愈伤组织的诱导

将无菌苗的根、下胚轴、子叶、真叶、节和节间切成长度0．5cm左右的片段，分别接入含有不同种类、不同浓度激素的MS培养基中，暗培养5d后转到光下培养，诱导愈伤组织。每周观察记录1次。培养4周，收获愈伤组织并置于60℃烘箱中烘干至恒重。

培养条件：温度（25±2）℃，光照强度为40 μmol／m2／s，光照时间12h／d。

1．4 愈伤组织中甘草总黄酮的测定方法

1．4．1 标准曲线的建立

以芦丁为参比标准，用分光光度法测定。精密称取在120℃下干燥恒重的芦丁对照品50mg，置25mL容量瓶中，加甲醇适量，置水浴上微热，使溶解，放冷，加甲醇至刻度，摇匀。精密量取10mL置100mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，既得芦丁标准溶液（每1mL含无水芦丁0．2mg）。精密量取上述溶液1、2、3、4、5、6mL，分别置25mL容量瓶中，各加水至6．0mL，加5%亚硝酸钠溶液1mL，混匀，放置6min，加10%硝酸铝溶液1mL，混匀，放置6 min，加1mol／L氢氧化钠试液10mL，再加水至刻度，摇匀，放置15min，以相应试剂为空白。在500 nm处测吸光度。

1．4．2 愈伤组织中总黄酮的提取

精密称取已研磨的光果甘草愈伤组织0．200g，以75%乙醇作为提取溶剂，料液比为1∶50，浸泡样品30min后超声提取40min，过滤。滤渣以1∶30料液比超声提取30min，过滤。合并两次滤液，置于25mL容量瓶中，75%乙醇定容。

1．4．3 愈伤组织中总黄酮的测定

精密吸取提取液5mL，加入1mL水，其次同标准曲线建立的测定方法，在500nm处检测，平行测定3次。总黄酮的计算公式如下：

P＝｛［（A＋0．00193）×5×V］／0．01075×m×106｝×100%。

上式中：P为总黄酮含量（%）；A为吸光度值；5为稀释倍数；V为提取液体积（mL）；m为愈伤组织干重（g）。

1．5 数据处理与分析

所有测定数据设3次重复，用Excel计算平均值，用Origin 7．0绘制标准曲线，用SPSS 17．0软件进行方差分析。

2 结果与分析

2．1 标准曲线的建立

以吸光度（A）为纵坐标，芦丁浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程：Y＝0．010705 X－0．00193，R＝0．9999。可见，在吸光度在0．084～0．513范围内与芦丁浓度之间存在良好的线性关系。

图1 芦丁标准曲线Fig．1The normal curver of rutin

2．2 6－BA与NAA组合对愈伤组织中总黄酮的影响

方差分析显示，激素水平（F＝22023．057，P＜0．01）、外植体（F＝3065．834，P＜0．01）、激素水平与外植体的互作（F＝2641．019，P＜0．01）对愈伤组织中总黄酮含量均有极显著的影响。每种外植体在5种激素水平下，其愈伤组织中总黄酮含量之间都具极显著差异（表1），但不同外植体愈伤组织黄酮含量随激素水平的变动格局存在差异。在6－BA 0．5～4．0mg／L与 NAA 1．0mg／L的激素组合中，6－BA 2．0mg／L与 NAA 1．0mg／L为根、下胚轴、子叶和真叶的最佳培养条件，愈伤组织中总黄酮含量最高，分别为1．945%±0．003%、1．771%±0．003%、1．843%和1．984%±0．003%。节和节间愈伤组织中总黄酮含量随着6－BA含量升高而升高，当6－BA 4．0mg／L与 NAA 1．0mg／L时，总黄酮含量最高，分别为：1．909%±0．003%和2．316%±0．015%。在 6－BA 与 NAA 组 合中，6－BA 4．0 mg／L与NAA 1．0mg／L为最佳激素水平，节与节间为最佳培养材料。

表1 6－BA与NAA组合对愈伤组织总黄酮含量的影响Tab．1The effects of 6－BA and NAA on contect of total flavonoids in callus

2．3 6－BA与2，4－D组合对愈伤组织总黄酮的影响

方差分析显示，激素水平（F＝3297．928，P＜0．01）、外植体（F＝5200．114，P＜0．01）、激素水平与外植体的互作（F＝410．093，P＜0．01）对愈伤组织中总黄酮含量均有极显著的影响。6种外植体之间达到极显著差异。每种外植体在5种激素水平下，愈伤组织中总黄酮含量都具极显著差异（表2）。在6－BA 0．5～2．0mg／L与2，4－D 1．0mg／L的激素组合中，6－BA 2．0mg／L与2，4－D 1．0mg／L为根和真叶的最佳培养条件，根和真叶愈伤组织中总黄酮含量最高，为1．135%±0．009%、1．193%±0．006%。节和节间随着6－BA含量的升高，总黄酮含量增加。在6－BA 3．0mg／L与2，4－D 1．0mg／L时，下胚轴、子叶、节和节间的总黄酮含量最高，为0．992%±0．003%、1．155%±0．007%、1．593%±0．006%和1．513%±0．003%。在6－BA 与2，4－D 组合中，6－BA 3．0mg／L＋2，4－D 1．0mg／L为最佳激素水平，节和节间为最佳培养材料。

表2 6－BA与2，4－D组合对愈伤组织总黄酮含量的影响Tab．2The effects of 6－BA and 2，4－D on contect of total flavonoids in callus

2．4 KT与2，4－D组合对愈伤组织总黄酮的影响

方差分析显示，激素水平（F＝5426．494，P＜0．01）、外植体（F＝5140．473，P＜0．01）、激素水平与外植体的互作（F＝483．973，P＜0．01）对愈伤组织中总黄酮含量均有极显著的影响，5种外植体之间达到极显著差异。每种外植体在5种激素水平下，愈伤组织中中黄酮含量都具极显著差异（表3）。在 KT 0．5～3．0mg／L与2，4－D 1．0mg／L的激素组合中，随KT含量的增加根、子叶、真叶、节和节间愈伤组织中的总黄酮含量均呈极显著递减趋势。在KT 0．5mg／L与2，4－D 1．0mg／L上培养时，愈伤组织中总黄酮的含量最高，分别为1．143%±0．003%、1．100% ±0．009%、1．043%±0．003%、1．164%±0．003%、1．124%±0．003%。下胚轴在KT 2．0mg／L与2，4－D 1．0mg／L时，愈伤组织中总黄酮含量达到最高值，为0．771%±0．003%。在KT与2，4－D组合中，KT 0．5mg／L 与2，4－D 1．0 mg／L为最佳激素水平，节、根、节间、子叶为理想培养材料。

表3 KT与2，4－D组合对愈伤组织总黄酮含量的影响Tab．3The effects of KT and 2，4－D on contect of total flavonoids in callus

3 讨论

植物激素通过调节植物细胞中各种酶的合成和活性来影响黄酮类化合物的产量。生长素和细胞分裂素可以调节蛋白质代谢，并且对植物基因的表达有显著的调节作用，从而调控黄酮类化合物合成中某些关键酶的活性［6］。6－BA与NAA组合中，总黄酮含量明显高于6－BA与2，4－D、KT与2，4－D组合。而且随着6－BA浓度升高，节间愈伤组织中总黄酮含量也随着上升，最高含量为2．316%±0．015%。6种外植体中，节间是外植体的最佳选择，6－BA与NAA组合是获得光果甘草节间愈伤组织总黄酮培养的最佳激素组合，6－BA 4．0mg／L与NAA 1．0mg／L为最佳激素水平。

野生光果甘草植株中总黄酮含量为3%左右［7－8］。人工栽培3年生光果甘草根中总黄酮含量为1．62%［9］，人工栽培6年生光果甘草根中总黄酮仅为0．31%［10］。通过组织培养4周获得的愈伤组织中总黄酮含量可高达2．316%。且6－BA与NAA组合时愈伤组织生物量较高，0．5g左右的外植体在培养4周后，可以得到1g左右愈伤组织的干燥粉末。甘草组培方法不仅极大地缩短了药材的生产周期，而且节约了大量土地，有效地缓解了药、粮争田的矛盾。因此，通过光果甘草愈伤组织培养生产总黄酮的方案是可行的。

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