维吾尔族子宫颈癌中HPV16变异体的初步研究

王刚刚，刘琳，尤伟艳，梁伟华，蒋金芳，李洪安，胡建明，常彬，赵瑾，李锋

（石河子大学医学院／新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，石河子832003）

人乳头瘤病毒（Human Papillomaviruses，HPV）为直径52～55nm的二十面体病毒，属于乳头瘤多空病毒科乳头瘤病毒属，人类是其唯一的宿主，皮肤及粘膜组织可被感染。根据未知HPV型L1序列与已知HPV型L1序列同源性，可对未知HPV进行定义，如果L1序列同源性小于90%，则定义为新的型（Type）；如果L1序列同源性在90%～98%，则定义为已知HPV型的亚型（Subtype）；如果L1序列同源性大于98%，则定义为已知HPV型的变异体（Variant）。目前，Yamada所描述的 HPV16变异体可分为如下几支：欧洲变异体（Eropean variant，E）、亚洲变异体（Asia variant，As）、亚－美洲变异体（Asia－American variant，AA）、非洲1变异体（Africa－1variant，Af－1）、非洲 2 变 异体（Africa－2variant，Af－2）、北美1变异体（North American 1，NA－1）［1］。HPV变异体的分布有明显的地域性差异与种族差异。

宫颈癌的主要病因有已经公认的高危型人乳头瘤状病毒（High risk－human papilloma virus，HRHPV）感染，研究发现某些HPV16变异体及某些位点的变异能增加患宫颈癌的风险。本实验通过软件客观地建立维吾尔族宫颈癌中HPV16变异体的系统发生树，初步研究维吾尔族宫颈癌中HPV16变异体的分布情况。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 病例收集 收集宫颈癌样本选取新疆喀什地区陆军第12医院和喀什地区人民医院病理科2001～2009年间维吾尔族宫颈鳞癌经手术切除、福尔马林固定、石蜡包埋组织，蜡块保留时间从3～10年不等。HPV16经深圳亚能膜芯片技术检测为HPV16阳性病例40例宫颈癌为研究对象。患者年龄25～65岁，中位45．00岁，平均（45．11±10．482）岁。HPV16质粒由德国海德堡大学HAUSEN教授馈赠。

1．1．2 引物

引物序列等详见表1。

表1 PCR引物序列Tab．1Sequences of PCR primers

PCR引物包括β－globin、HPV16E6引物，均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1．1．3 DNA及质粒抽提试剂盒 Qiagen石蜡组织提取试剂盒（凯杰生物技术上海有限公司）、高纯质粒小量制备试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司）．

1．2 方法

1．2．1 HPV16质粒的抽提及检测 （1）感受态细胞的培养、转染：挑取DH5α大肠杆菌原种，在LB琼脂板上划线，培养过夜，挑菌到LB液体培养基中，摇菌，移至离心管冰浴，离心回收细菌沉淀，加入冰预冷的CaCl2悬浮细菌沉淀，加入4mL 0．1 moL／L CaCl2重悬细菌沉淀，这时的细胞可直接用于转化实验。加甘油至终浓度为15%～20%，混匀，分装成200μL／份，－70℃冻存。取感受态细胞中加入连接产物，冰浴，水浴热激，立即冰浴；加液体LB复活；取200μL铺于含100μg／mL Amp、X－gal和IPTG LB平板；37℃恒温培养箱培养12～16h后观察。（2）摇菌及封存甘油菌制备和冻存：无菌条件下取小量培养的重组质粒的菌液1mL加入1．5 mLEp管中，再加入40%甘油0．5mL，混匀后用塑料薄膜封口，－80℃保存。（3）质粒抽提：从恒温摇床中取出培养的成云雾状浑浊的细菌，离心，弃上清，收集菌体，用溶液P1重悬菌体沉淀，漩涡振荡，加入溶液P2混合，使菌体充分裂解，直至溶液变得清亮，加入溶液P3，立即温和翻转，室温放置5min，离心，取上清；将上清液加入吸附柱AC中，离心，弃滤液。加入去蛋白PE，离心，弃滤液。加入漂洗液WB，离心，弃滤液。空柱，离心，室温晾干；取出吸附柱AC，放入离心管中，加入双蒸水，室温放置1 min，离心洗脱DNA，即为提取的质粒DNA溶液，－20℃保存，取1μL在1%琼脂糖凝胶上电泳检测其纯度。

1．2．2 基因组DNA的制备及检测 组织切片（5 μm）10张，装入2．0mL的灭菌Ep管中；加入二甲苯脱蜡，离心，弃上清，加入无水乙醇，离心弃上清，晾干，加细胞裂解液轻混，加蛋白酶K轻混，封口，水浴过夜；95℃水浴5min灭活蛋白酶K，离心，迅速加入Buffer AL，震荡混匀，加入无水乙醇，震荡混匀；离心后转移全部裂解液至QIAamp层析柱，离心，将柱子放入干净收集管，打开柱子，加入Buffer AW1（用前轻混），离心，将柱子放入干净收集管，打开柱子，加入Buffer AW2，离心；将柱子放入干净收集管，全速离心，使膜完全干燥；将柱子放入干净的Ep管中（试剂盒未提供），打开柱子，加入Buffer ATE，室温下盖盖孵育，全速离心，所得产物－20℃冻存备用。NanoDrop分光光度计定量检测DNA浓度及纯度。

1．2．3 PCR扩增目的片段 25μL的反应体系检测β－globin、HPV16E6F1R1、HPV16E6F2P2，见表2。

反应条件：94℃4min（1×）；94℃45s，退火45s，72℃45s（35×）；72℃10min（1×）。退火温度由左到右分别为56℃，54℃，56℃，52℃。扩增完后在2%琼脂糖凝胶中电泳检测PCR产物质量。质量合格PCR产物送交Invitrogen公司纯化后，双向测序。

表2 PCR反应体系Tab．2Systems of PCR reactions

1．2．4 HPV16变异体进化树构建 参照序列Gen－Bank编码如下：SihaHPV16E6（AF003019．1）；CaskiHPV16E6（AF003018．1）；HPV16EP （K02718．1）；HPV16E131G（AF536179．1）；HPV16As（AJ388066．1）；HPV16AA（AF402678．1）；HPV16Af1（AF536180．1）；HPV16Af2（AF486324．1）HPV16NA－1（AF486325．1）；Xinjiang HPV16E6（AF327851．1）。

用Chromas软件查看测序波峰图，用DNAStar软件中Seqman程序分析、拼接、与标准序列比较发现其中变异位点，后用其中EditSeq程序将拼接好的核苷酸序列与标准序列翻译为氨基酸序列并加以比对分析发现氨基酸变化，应用Clustal 1．80将核苷酸序列比较并将文件的格式由“＊．seq”转变“＊．aln”，后者用 MEGA4．1 软件分析并构建HPV16系统发生树。

1．3 统计学分析

样本HPV16变异与临床病例资料分析，采用卡方检验分析两两之间的相关性。计数资料用率或构成比表示，计数资料组间的比较使用行×列表资料的χ2检验，P＜0．05视差异性有统计学意义。所有数据用SPSS17．0软件包处理。

2 结果

2．1 基因组DNA检测结果

所选新疆维吾尔族宫颈癌40例，经β－globin PCR扩增检测成功37例。PCR扩增产物做2%琼脂糖凝胶电泳，210bp处出现目的片段（图1），说明样本DNA均可用于HPV16变异检测。

维吾尔族宫颈癌中β－globin PCR扩增检测阳性37例样本，全用于HPV16E6扩增。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳，214bp（35／37例）、343bp（31／37例）处出现目的片段（图2），说明实验样本可用于后续的测序。

图1 宫颈癌β－globin扩增电泳Fig．1Electrophotogram ofβ－globin amplification in cervical cancer

图2 宫颈癌HPV16E6扩增电泳Fig．2Electrophotogram of HPV16E6amplification in cervical cancer

2．2 HPV16变异位点分布

扩增目的片段E6测序波峰图用Chromas及DNAstar软件查看并分析序列。维吾尔族宫颈癌37例，28例测序成功，E6变异率71%（20／28），其中T350G变异率71%（20／28），178位点未见变异，发生T310G变异1例（152号），T295G变异1例（167号），A135C变异1例（167号）。

结果见图3和表3。

表3 28例维吾尔族子宫颈癌中HPV16E6变异情况Tab．3Variations of HPV16E6in 28cases Uighur's cervical cancer

图3 宫颈癌HPV16E6变异位点波峰图Fig．3Wave crests of HPV16E6variant sites in cervical cancer

2．3 系统进化树构建分析

根据HPV16E6序列构建进化树，从图4、5可看出，NA－1、AA、Af1与Af2变异体分支较晚，进化较慢，一直比较稳定，而欧洲变异体及As变异体则早早的就分支，相对不稳定，所选维吾尔族宫颈癌样本欧洲变异体为主。19例样本121、132、134、138、140、142、143、149、150、152、155、164、166、167、170、175、178、183、246归为欧洲变异体，其中9例样本125、130、145、148、151、169、179、239、244 归为欧洲标准体。

图4 宫颈癌HPV16E6无根树Fig．4Unrooted tree of HPV 16E6 in cervical cancer

图5 宫颈癌HPV16E6有根树Fig．5Rooted tree of HPV 16E6in cervical cancer

2．4 HPV16变异与宫颈癌临床特征的相关性

宫颈癌中HPV16变异分型与组织分化程度相关性的比较结果见表4。

在本实验中，维吾尔族宫颈癌有HPV16欧洲标准体（Ep）和HPV16欧洲变异体（E131G）2种感染，感染率分别为 32．14% （9／28）、67．86%（19／28），以HPV16欧洲变异体为主。HPV16变异体分型与组织学分化程度通过秩和检验，两者间没有相关性（P＞0．05）。

表4 宫颈癌中HPV16变异分型与组织分化程度相关性比较Tab．4The correlation comparison between HPV16variant branch and histo－differentiation degree in cervical cancer

另外把HPV16E6 350位点变异与组织分化程度用秩和检验比较相关性，结果两者之间不存在相关性（P＞0．05），见表5。HPV16E6 350位点变异与年龄分组用确切概率法分析，相关性，结果两者之间不存在相关性（P＞0．05），见表6。

表5 宫颈癌中HPV16E6 350位点变异与组织分化程度的相关性比较Tab．5The correlation comparison between HPV16E6variant of 350 site and histo－differentiation degree in cervical cancer

表6 宫颈癌中HPV16E6 350位点变异与年龄分组间相关性比较Tab．6The correlation comparison between HPV16E6 variant of 350siteand age groups in cervical cancer

3 讨论

宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一，发病率在女性癌症中仅次于乳腺癌。在我国新疆南疆地区维吾尔族宫颈癌呈现民族集聚高发现象，其汉族发病率明显低于维吾尔族［2］。新疆南疆维吾尔族妇女宫颈癌的患病率由527／10万（2004年）上升到622／10万（2008年）［3］，近年其发病年龄趋于年轻化［4］其发病率及死亡率在我国新疆少数民族中最高。目前宫颈癌的主要病因有已经公认的高危型人乳头瘤状病毒（High risk－human papilloma virus，HR－HPV）感染，另外与生活环境卫生状况差、多个性伴侣、多孕多产等环境因素和生活行为相关［5］。其中HPV致癌的重要性逐渐成为研究热点。

3．1 HPV16常见变异位点及其致癌性

HPV16变异体中的某些特定位点的改变能增加肿瘤的易患性。大量文献报道某些位点变异后能增加疾病的易患风险。Rubén López－Revilla等［6］在墨西哥圣路易斯发现1个AA变异AA－a（5．3%）及 3 个 E 变 异：E－P（71．1%），E－T350G（18．4%），E－C188G（5．3%），未发现非洲变异体。除了E变异外，还发现了24处新的核苷酸改变，其中最常见的是A334G变异，A334G变异在高级别上皮内瘤变和侵袭性宫颈癌内所占比例要高于E－P相关的其他变异。作者认为E－P A334G变异相比于E－P原型更具有致癌性。

有研究认为E6的T350G变异与增加宫颈疾病进展的风险有关。Martha Grodzki等［7］报道在法国有 HPV持续感染（OR，2．4%；95%CI＝1．3～4．3）和进展为高级别损伤（OR＝4．2%；95%CI＝2．1～8．1）的女性患者相比于其他高危HPV感染型更易受到HPV16的感染。值得关注的是，在隐匿有HPV16T350G变异感染的女性中，感染呈持续进程者（OR＝3．0；95%CI＝1．4～6．7）和进展进程者（OR＝6．2；95%CI＝2．7～14．3）OR值明显提高，Koji Matsumoto等［8］发现日本女性中 HLA DRB1＊1502与HPV16E变异D25E感染呈正相关，而HLAⅡ等位基因与L83V变异未发现相关性。这提示HPV之所以能够持续感染除了与各民族清除病毒能力差异有关外，还与民族易感HPV变异体类型及HPV病毒自身变异导致表达差异，而发生的免疫逃逸机制相关。

3．2 HPV16变异致宫颈癌机理

E6读码框内第350位碱基由T变为G，密码子编码的第83位氨基酸由L变为V，T350G（L83V）突变可以导致重要的编码蛋白改变，而这些改变的编码蛋白能增强下游信号途径的表达，如HPV16 E6T350G变异在宫颈癌细胞株中可以增强MAPK通路信号，并且协同Notch信号通路和抑制Ras介导的转化而导致宫颈癌发生［9］。HPV18E6变异可激活细胞存活和扩增中起重要作用的Akt／PKB及MAPKs信号通路［10］。

新疆所处位置是欧亚大陆结合地，而且古代的政治婚姻以及战略人口迁徙、欧亚经商比较频繁，新疆地区民族就有47个，其中以维吾尔族和哈萨克族为主，这就为HPV形成多种变异提供了基础。对于新疆维吾尔族宫颈癌变异，前期研究者已有报道［11－12］，但是都未从病毒进化理论角度对宫颈癌中感染的HPV16变异体进行分析研究。本实验建立了新疆维吾尔族宫颈癌HPV16进化树，从进化理论角度更客观对HPV16变异体进行分析研究。发现维吾尔族宫颈癌以HPV16E变异体为主，且主要变异位点为350位点，并发现135、295、310两个位点有变异。这与前期研究者报道相似，但是这些位点的变异与宫颈癌的相关性及350位点变异的致癌机理需要进一步的研究。

3．3 问题与展望

目前，病毒致瘤学说越来越引起大家的重视，HPV16属于高危致瘤病毒，已被公认为是诱发宫颈癌的危险因素之一，且在美国已有HPV四价疫苗在临床应用，四价疫苗是针对特异片段设计，而各地区HPV变异后是否使片段失去这种特异性，而致疫苗效力下降，值得每个关心此领域的人重视。HPV16某些高危位点的变异对机体有很大的成瘤危险性。而本实验中这些位点是否变异在宫颈癌中表达会出现何种差异，此种差异是否与宫颈癌的发生有相关性？这还需要研究者在病毒致瘤领域做进一步的研究。

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