化学诱导剂与玉米花粉诱导小黑麦单倍体的技术

王雪玉，魏凌基，殷稳娜，聂石辉，杨玉玲，孔广超

（石河子大学麦类作物研究所，石河子832003）

小黑麦是由小麦和黑麦经属间人工杂交及染色体加倍培育而成的一个新物种，不仅具有小麦籽粒高产、优质的特点，同时又继承了黑麦生物产量高、耐逆性强的特性。目前，小黑麦已成为了一种重要粮食与饲草等多种用途的作物［1］。

孤雌生殖与花药培养均属于单倍体育种的方式，是育种过程中加速世代稳定的重要途径之一［2－4］。自1964年人们经过花药离体培养获得单倍体后，应用单倍体技术进行的品种改良进入了迅速发展的时期。但对于普通小麦而言，这种产生单倍体的方法，不仅成苗率低，而且会产生大量的白化苗。1975年Barely利用普通小麦与球茎大麦杂交获得了高频率的小麦单倍体［5］，Zenkteler［6］最早报道了六倍体普通小麦与玉米之间的远缘杂交，随后Laurie［7］证明了小麦与玉米杂交后，在最初的3次细胞分裂中，来自父本玉米的染色体被完全排除，从而形成了仅有21条母本小麦染色体的单倍体胚。

自1984年Zenkteler等首次开展了小麦与玉米远缘杂交获得小麦单倍体以来［8］，国内外开展小麦与玉米杂交研究的报道较多［9～16］，但在利用玉米花粉刺激小黑麦雌蕊以获得六倍体小黑麦单倍体方面还鲜有研究［17］。然而利用玉米花粉诱导小黑麦单倍体时因玉米开花期与小麦、小黑麦开花期等难以相遇，给玉米花粉诱导小黑麦单倍体带来了技术障碍［18－19］。

本研究拟开展利用化学药剂单独使用与化学药剂结合玉米花粉来诱导小黑麦孤雌生殖以形成的六倍体小黑麦单倍体进行初步研究，旨在为加速小黑麦育种进程、缩短育种年限、提高杂交育种效果奠定基础。

1 材料与方法

1．1 材料

试验所用六倍体小黑麦材料均为石河子大学麦类研究所培育的冬性小黑麦杂交组合F1。玉米品种为普通玉米早熟品种农家种哈密六十黄。

1．2 方法

1．2．1 试验材料的种植

2008年9月将供试的冬性六倍体小黑麦播种于石河子大学农学院实验站，采用人工点播，株距5 cm，行距20cm。

为确保玉米与小黑麦开花期相遇，将所用玉米品种分别于2009年3月9日、16日、23日分三期播于石河子大学农学院育种家种子库温室，以实现玉米花粉散粉期和六倍体小黑麦的开花期相遇。

1．2．2 试验材料的处理

1）化学药剂处理。在小黑开花期，先采用常规去雄方法，对即将开花授粉的穗子进行整穗、剪颖、去雄、套袋。次日采用小花滴注法利用化学诱导剂（二甲基亚砜40mL／L，秋水仙素4g／L，肌醇100 mg／L，吲哚乙酸20mg／L和2，4－D 20mg／L）［17］处理已去雄麦穗。处理后套袋、挂牌，标明处理日期。48h后再用同样化学药剂重复滴注1次。共处理15个F1组合，每个组合处理5穗。

2）玉米花粉与化学药剂的复合处理。按前述方法对未开花授粉的六倍体小黑麦进行去雄、套袋。在去雄后的次日，采集新鲜玉米花粉用毛笔蘸花粉涂抹于去雄小花上，以进行授粉杂交，而后进行套袋，挂牌，标明处理日期。第2天同一时间用上述化学药剂再滴注1次。处理的六倍体小黑麦F1组合及每组合的穗数均同化学诱导方法。

1．2．3 胚拯救

经化学诱导剂以及化学诱导剂与玉米花粉复合处理后得到的单倍体胚大部分都不具有胚乳，因此必须采取培养基培养等方法对其进行胚拯救。

两种方法处理后的第16天分别采集上述两种方法诱导过的六倍体小黑麦麦穗，带回实验室，剥离出已膨大的子房，统计颖果数。并将其用质量浓度为0．1%升汞溶液灭菌6～8min，用无菌水充分冲洗3次。在超净工作台上，借助于立体解剖镜剥出幼胚，统计单倍体胚数，并将其分别接种于1／2MS培养基和B5改良培养基（B5基础培养基添加30%蔗糖）上。将幼胚在25℃下暗培养1周后，再移入25℃光照培养下至长成幼苗。分别按以下方法计算颖果率、得胚率、萌发率及成苗率。

颖果率（%）＝（各处理颖果数／各处理授粉小花数）×100%；

颖果得胚率（%）＝（各处理颖果得胚数／各处理颖果数）×100%；

得胚率（%）＝（各处理所得单倍体胚数／各处理授粉小花数）×100%；

萌发率（%）＝（各处理接种单倍体幼胚数／萌发胚数）×100%；

成苗率（%）＝（各处理成苗数／各处理接种单倍体幼胚数）×100%。

2 结果与分析

2．1 诱导方式对小黑麦单倍体胚形成效率的影响

化学诱导剂与玉米花粉结合化学诱导剂复合诱导冬性小黑麦后，其单倍体得胚率见表1。

由表1可见，经化学药剂单独处理的小花总数为3120个，其颖果率为5．90%，颖果得胚率为7．03%，总的得胚率为5．89%。经玉米花粉与化学药剂复合诱导共处理的小花数为2545个，其颖果率为12．84%，颖果得胚率为10．12%，总得胚率为12．90%。这说明经花粉与化学药剂复合处理诱导六倍体冬性小黑麦单倍体较化学药剂单独处理的效果好。

表1 两种诱导方式下六倍体小黑麦单倍体胚形成率Tab．1Effect of different produced methods on haploid embryo formation of wheat

结果见表2。由表2可见，化学诱导剂所处理的15个六倍体冬性小黑麦组合中，其颖果率为0～30．45%，平均为5．89%，可见不同组合的六倍体小黑麦经化学药剂诱导后的颖果率存在明显差异，即不同基因型在化学药剂诱导下其颖果的形成能力存在差异，其中诱导颖果率最高的组合是 WH08－7／07H519－520，可作为良好的单倍体胚诱导源。而在玉米花粉与化学药剂复合诱导的15个冬性六倍体小黑麦组合中，其颖果率为0%～39．80%，平均为12．84%，其中颖果率最高的组合为 07H261－62／NTH2146－2。可见玉米花粉与化学药剂复合处理对不同六倍体小黑麦组合的颖果率具有明显的差异，同时玉米花粉与化学诱导剂复合诱导的颖果率总体上略高于单一的化学诱导剂的颖果率。

表2 两种处理方式下的六倍体冬性小黑麦颖果率 %Tab．2Frequencies of caryopsidsis of hexaploid winter Triticale induced by chemiclas vs maize pollen and chemicals

所处理的15个组合中有11个组合在玉米花粉和化学药剂的复合诱导下其颖果率有所提高。从两种诱导方式下的最高颖果率和15个小黑麦组合的平均颖果率来看，玉米花粉与化学药剂的复合处理的最高值和平均值均较化学药剂较高。但对两种诱导方式下的颖果率进行成对数据的平均值分析表明，颖果率间的差异未达到显著差异（t＝2．14，P＝0．145），但玉米花粉与化学药剂复合作用诱导的颖果率的变幅、平均值和方差均大于化学药剂单一诱导作用。

2．2 不同小黑麦组合对颖果率的影响

结果见表3。由表3可见，经玉米花粉与化学药剂复合处理的15个小黑麦组合中，颖果率最高的组合 07H261－62／NTH2146－2 与 最 低 组 合 WH08鉴2／07H255－56的颖果率相差39．80%，差异达极显著水平，这说明不同小黑麦基因型在诱导单倍体性能上具有显著差异。

表3 不同小黑麦组合与玉米杂交的颖果率Tab．3Frequencies of caryopsidsis in different Triticale×maize crosses

2．3 培养基对六倍体冬性小黑麦幼胚成苗率的影响

由于经玉米花粉或化学诱导剂诱导形成的幼胚缺乏胚乳，在发育过程中会夭亡，因此需对其幼胚进行拯救培养。将上述两种诱导方式下所诱导出的幼胚剥离出来，分别接种于1／2MS培养基和改良B5培养基上进行胚拯救，不同小黑麦组合在这两种培养基上的幼胚成苗率也存在不同程度的差异，各组合的幼胚成苗率见表4。

由表4可见，经1／2MS培养基培养的幼胚成苗率为0～100%，组合间的成苗率方差为926．05，平均为25．16%，其中有3个组合幼胚未诱导成苗，组合 WH08鉴2／07H255－56的幼胚 成 苗 率 为100%，可见不同基因型其幼胚成苗率之间具有较大差异。在改良B5培养基上进行胚拯救中，共有4个组合未拯救出幼苗，而幼胚成苗率最高组合为WH08鉴2／NSDW57－3，其幼胚成苗率为94．28%，15个组合的平均幼胚成苗率为31．41%。组合间的幼胚成苗率方差为933．79。从其15个组合的平均幼胚成苗率来看，经改良B5培养基拯救的幼胚成苗率要略高于MS培养基，但经成对数据的t检验分析表明，两种培养基在幼胚拯救中对其成苗率的影响未发现存在显著差异（t＝2．14，P＝0．49）。

表4 两种培养基下的六倍体冬性小黑麦幼胚成苗率 %Tab．4Seedling rate of hexaploid winter triticale on two mediums types

3 讨论与结论

1）本试验结果表明，六倍体冬性小黑麦不同组合在化学诱导剂及玉米花粉和化学诱导剂复合诱导下，其形成单倍体胚的能力有所不同，其颖果率分别为0%～30．45%和0%～39．8%，可见基因型效应对六倍体冬性小黑麦颖果率具有明显差异。同时不同组合在两种胚拯救培养基上的幼胚成苗率也具有有明显差异，15个组合的单倍体幼胚成苗率分别为0%～100．0%和0%～94．28%。这些均表明不同的六倍体小黑麦组合在接受化学诱导剂和玉米花粉与化学药剂的复合诱导后形成单倍体胚的能力有明显差异，同时不同组合的幼胚在拯救培养基上的成苗率也有差异。这与前人［20］在小麦方面的研究结论相似。这表明选择具有较高单倍体胚诱导能力和较高单倍体胚成苗率的基因型是六倍体小黑麦单倍体形成及其单倍体育种技术的基础。

2）在本研究所采用的两种单倍体胚诱导方式中，尽管玉米花粉与化学诱导剂复合处理与单一化学诱导剂对所检测的15个冬性小黑麦组合的颖果率平均数间无显著差异，但大部分组合在玉米花粉和化学诱导剂的复合诱导下其颖果率较高。这与在有关小麦报道［21］的玉米花粉与激素配合使用来诱导小麦产生单倍体的效果较好的结论基本一致，但也有部分组合化学诱导剂处理的颖果率较玉米花粉和化学诱导剂复合处理的颖果率高，这可能是由于不同的基因型所致。这表明不同六倍体小黑麦组合在选择较高颖果率时诱导方式的复杂性，需要针对不同杂交组合来选择较优的诱导方式。然而，在实际应用中，选用玉米花粉和化学诱导剂的复合诱导，必须调整玉米散粉期与小黑麦的开花期相遇，而不同的播种期和不同发育速度造成了这种花期调整的困难［22］，而相比之下，化学药剂诱导不存在季节和花期不遇的限制，具有更方便的应用价值。

3）本实验中，分别采用了改良B5培养基和1／2 MS培养基对获得的单倍体幼胚进行拯救。在这两种胚拯救培养基上，各组合的幼胚成苗率存在明显差异，尽管在两种培养基间15个组合的幼胚成苗率平均值略有差异，但未检测到显著的差异。相同组合在两种培养基上的幼胚成苗率间的变化也无统一规律。这些均反映出了基因型与胚拯救培养基选择的复杂性，应针对每种基因型有针对性地选择相应的拯救培养基方可取得最优的成苗率。

4）长期以来，利用玉米花粉诱导小麦单倍体的研究较多［7－13，17－18，20－22］。而作为小麦与黑麦人工远缘杂交和染色体加倍培育的新物种小黑麦，在自然情况下因其染色体来源不同，在常规育种中，分离严重，稳定需要的世代数多，延缓了小黑麦常规育种的进程。本研究初步比较了化学诱导剂和玉米花粉与化学诱导剂复合处理对不同组合六倍体冬性小黑麦单倍体胚的诱导和1／2MS和改良B5培养基对小黑麦单倍体胚幼苗成苗能力的影响，其结果将会对小黑麦孤雌生殖单倍体育种具有指导意义，进而为更好的获得DH（double haploid）群体，缩短育种年限，推动小黑麦的育种进程具有直接的指导意义。

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