靶向抑制CXCR7基因表达对结肠癌生长的影响

王红鲜 陶霖玉 齐 柯 张好云 冯 铎 孔 恒 林秋生 陈天文

趋化因子及其受体家族在肿瘤的增殖、转移过程中扮演重要角色。CXCR7，以前称“孤儿G蛋白偶联受体(RDC1)”，属于趋化因子受体家族，是一条肽链的7-跨膜受体，与趋化因子-12(CXCL12)具有高亲和力，表达于许多肿瘤细胞系，直接参与调节肿瘤的发生发展[1]。

分子靶向治疗是抗肿瘤特异性治疗的最高层次。以细胞恶变的分子事件为治疗靶点，从分子水平来逆转肿瘤的恶性生物学行为，抑制肿瘤细胞生长，或阻断细胞恶变的基础和环境[2,3]，从根本上动摇和消灭肿瘤的方法和策略，已经受到学术界的广泛关注。本文采用RNA干扰的方法，通过构建人结肠癌荷瘤裸鼠动物模型，在瘤体内多点注射CXCR7的重组慢病毒shRNA表达载体，观察其对荷瘤裸鼠瘤体生长的影响，探讨体内靶向抑制CXCR7的表达对结肠癌的调控作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

BALB/c雌性4周龄裸鼠24只，体重12～14 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[许可证号SCXK(沪)2007-0005]，饲养于层流玻璃罩内，饲料及饮水均经灭菌处理。

1.2 细胞株

HT-29(人结肠癌细胞株)购自中南大学湘雅医学院细胞中心，采用RPMI 1640完全培养基(含10％小牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素)，置5％CO2的37℃饱和湿度的培养箱内培养。

1.3 人CXCR7基因特异性RNAi慢病毒表达载体

设计人CXCR7基因(GeneBank，NM_020311)的siRNA靶点序列“gcagccggaagatcatcttct”(https://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/design.do)，并经Genebank数据库BLAST检索，确认无其它同源序列。合成CXCR7基因的shRNA片段(引物：Forward，5’-accacgcgtg gcagccggaagatcatcttctctctcttgaattc-3’；Reverse，5’-aaaatcgataaaaaa gcagccggaagatcatcttctgaattcaagagag-3’)，酶切shRNA互补双链产生黏性末端，酶切plVTHM质粒(干扰质粒)使之线性化，37℃ 3h后电泳凝胶回收，采用T4连接酶连接，既得plVTHM-CXCR7shRNA重组质粒。将慢病毒包装的四质粒系统(plVTHM-CXCR7shRNA重组质粒，pRsv-Rev，pMDlg-pRRE和pMD2G)共转染293T细胞，72 h后收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，并过滤、纯化[2]。

1.4 人结肠癌动物模型的建立及分组

1.4.1 建立人结肠癌荷瘤裸鼠动物模型 常规胰酶消化生长状态良好的人结肠癌细胞株HT-29，制成单细胞悬液，800 rpm/min离心5 min，PBS液清洗并重悬细胞，调整细胞浓度至2.5×107/ml。

用1 ml注射器吸取HT-29细胞(约0.2 ml，含5×106个细胞)，接种于每只裸鼠背部皮下(注意勿接种到皮内)，1周左右100％成瘤(成瘤标准：瘤体直径超过0.5 cm)。

1.4.2 动物分组 将人结肠癌荷瘤裸鼠随机分为3组，每组8只，进行瘤体内多点注射给药。治疗组：50 μl LV-CXCR7shRNA(4×108TU/ml)；阴性对照组：50 μl LV-shRNA negative control(4×108TU/ml)；空白对照组：50 μl PBS。

1.5 给药后24天瘤体的体积与重量

人结肠癌荷瘤鼠瘤体内给药后第24天，用游标卡尺测量肿瘤的最长径(a)和与之垂直的最短径(b)，根据公式计算瘤体体积(V)：V=ab2×0.52(cm3)[3]。之后拉颈处死裸鼠，剥离皮下肿瘤，称取瘤体重量。

1.6 Western blotting测定给药后24天各组CXCR7蛋白表达

常规RIPA及PMSF提取各组荷瘤鼠瘤体总蛋白，取等量变性蛋白样品于SDS-PAGE胶中电泳，在Bio-Rad半干式电转仪中转至硝酸纤维素膜上，5％脱脂奶粉-PBST封闭非特异蛋白。用一抗(1∶500稀释兔抗CXCR7，1∶1 000稀释兔抗GAPDH)室温孵育2 h，洗膜后再用二抗(1∶1 000稀释的羊抗兔IgG-HRP)室温孵育2 h，ECL显色、曝光显影，Gene Genius凝胶成像系统成像，Quantity One 4.62(Bio-Rad)凝胶分析软件测定各条带的光密度值，结果以积分光密度值(integral optical density，IOD)表示，以IODCXCR7/GAPDH作为CXCR7蛋白的相对量。

1.7 统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件，统计数据用均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用S-N-K法，P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 瘤体内给药后的肿瘤体积

在人结肠癌荷瘤裸鼠瘤体内给药后第24天，所有动物均存活。与2组对照组比较，治疗组瘤体体积显著缩小(P<0.05)；阴性对照组和空白对照组比较无显著性差异(P<0.05)，见表1，结果表明靶向抑制CXCR7的表达，可使人结肠癌荷瘤鼠的瘤体生长显著受抑。

表1 各组荷瘤鼠瘤体体积(±s)

表1 各组荷瘤鼠瘤体体积(±s)

组别n体积F值P值治疗组80．90±0．1414．040．00阴性对照组81．35±0．23空白对照组81．42±0．17

2.2 瘤体内给药后24天的瘤重

拉颈处死荷瘤裸鼠，大体解剖未发现远处转移灶，剥离皮下肿瘤，测量瘤体的重量，结果发现治疗组瘤重显著轻于阴性对照组和空白对照组(P<0.05)；阴性对照组和空白对照组比较差异无显著性(P>0.05)，见表2和图1，提示慢病毒CXCR7shRNA表达载体能明显抑制瘤体生长。

图1 各组荷瘤鼠的瘤体组织

a1,a2为治疗组； b1,b2为阴性对照组； c1,c2为空白对照组

表2 各组荷瘤鼠瘤体重量(±s)

表2 各组荷瘤鼠瘤体重量(±s)

组别n瘤重F值P值治疗组80．39±0．134．9570．017阴性对照组80．63±0．19空白对照组80．58±0．17

2.3 瘤体组织中CXCR7蛋白表达水平

在大小约52 kD(目的蛋白CXCR7)和37 kD(内参蛋白GAPDH)处，各组织标本均有特异性条带(图2)。治疗组CXCR7蛋白表达水平低于阴性对照组和空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)(因液氮冻存罐炸裂，数个标本丢失，故每组均等取6个标本)；阴性对照组和空白对照组比较无统计学差异(P>0.05)，见表3和图2，提示瘤体内注射靶向CXCR7的shRNA慢病毒表达载体，能有效降低荷瘤裸鼠瘤体组织中CXCR7蛋白的表达水平。

图2 Western blotting检测CXCR7蛋白表达

表3 Western blotting检测各组中CXCR7蛋白表达

3 讨论

结肠癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，其发生发展过程涉及一系列分子事件，趋化因子CXCL12及其受体CXCR4的异常表达是结肠癌生长和转移的关键因素[4]。CXCR7是近年发现与CXCL12具有高亲和力的受体[5]。研究发现，趋化因子受体CXCR7在许多人类恶性肿瘤中呈高表达，包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌等，且随肿瘤侵袭性的增加而表达量增多，但在正常组织标本中不表达或少表达[6]。S Iwakiri[7]研究发现，高表达CXCR7的Ⅰ期非小细胞性肺癌患者术后复发率显著增高、5年无瘤生存率明显降低。

体外实验证实CXCR7能提高肿瘤细胞的生长、黏附和侵袭能力[8～10]，CXCR7在体内是否参与调控肿瘤的发生发展？Burns[5]在小鼠肿瘤模型的研究中发现，CXCR7能调节恶性肿瘤的生物学性质，促进肿瘤进展。有学者用CXCR7的小干扰RNA(small interference ribonucleic acid,siRNA)，使CXCR7在乳腺癌细胞株4T1中表达减少到10％，体内成瘤性显著降低[9]；将CXCR7序列导入乳腺癌细胞MDA-MB435s，体内成瘤性显著提高[9,11]；自小鼠尾静脉分别注射上述2种转染了CXCR7基因序列的肿瘤细胞，其肺部的转移、侵袭能力显著增加[9]。Burns等[5]从约10万个小分子化合物中筛选出2个CXCR7拮抗剂，将表达CXCR7的肿瘤细胞接种至小鼠，同时给予拮抗剂处理，结果发现接受拮抗剂处理的小鼠，其肿瘤的生长趋势显著降低。值得关注的是转导CXCR7的正常细胞有恶性转化潜能，将CXCR7导入小鼠成纤维细胞NIH-3T3能促进其增殖和成瘤[9]。BKSHV(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus)与人淋巴细胞增生性疾病和卡波肉瘤密切相关，裸鼠体内实验显示CXCR7的siRNA能抑制KSHV感染所致的细胞恶性转化[12]。上述结果提示CXCR7在恶性肿瘤的演变过程中可能发挥重要作用。

探讨CXCR7对结肠癌生物学性质的调控，有望为恶性肿瘤的治疗提供了一个新的策略。本文以人结肠癌荷瘤裸鼠为研究对象，以CXCR7为分子靶标，以shRNA重组慢病毒载体为治疗介质，研究靶向沉默CXCR7基因的表达对人结肠癌荷瘤裸鼠瘤体生长的影响，结果发现瘤体的体积显著减小、重量显著减轻，CXCR7的靶向沉默效应经Western blotting检测予以证实，提示靶向抑制CXCR7基因的表达能显著抑制人结肠癌荷瘤裸鼠的瘤体生长，CXCR7可能参与促进结肠癌的恶性进展，是人结肠癌治疗潜在的分子靶标。

RNA干扰(RNA interference,RNAi)诱发的转录后基因静默机制，即同源性mRNA的降解，是研究基因功能、探讨药物治疗靶标的有力工具[13,14]。siRNA是RNAi的效应分子[15]，但其稳定性较差，容易被核酸酶降解，且不易透过生物膜。慢病毒以其转染效率高、能将遗传物质整合到靶细胞基因组、可持续性表达等优势，为RNAi提供高效、安全、稳定的表达载体。本文采用慢病毒介导的RNA干扰方法，从实验动物水平探讨CXCR7与人结肠癌的关系，以期为结肠癌的治疗带来新的方案。本文针对CXCR7基因序列设计的siRNA序列进行了严格的BLAST比对，以保证和其他基因的非同源性，提高对CXCR7靶基因沉默的特异性。

CXCR7的信号传导及其对肿瘤调节机制尚不确切。推测其信号传导可能是通过结构性激活机制来活化细胞，此结构性激活机制通过可逆性地与配体结合的形式活化。有报道[8]CXCR7参与上调TGF-β1(transforming growth factor-β1)的表达，后者可诱导上皮细胞向间叶细胞转化，这与肿瘤的发生发展关系密切。配体活化的CXCR7还可能激活AKT信号传导通路，有利于肿瘤生长。此外，CXCR7可能诱导白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)和血管内皮生长因子(vessel endothelium growth factor,VEGF)表达，参与调控肿瘤血管生成。趋化因子及其受体所调节的肿瘤生长微环境比以往的认识要复杂得多，值得学术界进一步探索发现。

[1]Balabanian K,Lagane B,Infantino S,et al.The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes〔J〕.J Biol Chem,2005,280(42):35760.

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[9]Balabanian K,Lagane B,Infantino S,et al.The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes〔J〕.J Biol Chem,2005,280(42):35760.

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