藤梨根诱导人食管癌Eca-109细胞凋亡的调节机制

国宏莉 李江华 李 斌 度长海 张 丽

藤梨根又称阳桃根，为植物猕猴桃科藤梨(软枣猕猴桃)Actinidia arguta(Sieb.teZucc.)Planch或猕猴Achinensis Planch的根。近年来，藤梨根的抗肿瘤作用引起了国内外部分学者的关注，并在构效分析研究的指导下获得了许多肿瘤细胞毒活性明显提高的衍生物[1～3]。因此，了解藤梨根抗肿瘤作用的机制对于评价藤梨根及其衍生物作为抗肿瘤药物开发的潜力和指导衍生物的合成具有重要意义。我们前期研究表明藤梨根能明显抑制人食管癌Eca-109细胞的生长，并能诱导细胞凋亡[4]。但细胞凋亡的机制尚不清楚，这引起了我们极大的兴趣。本研究中，我们将对藤梨根诱导人食管癌Eca-109细胞凋亡，凋亡与Bax、Bcl-2蛋白表达及Caspase活化的关系进行探讨。

1 材料与方法

1.1 细胞株与细胞培养

人食管癌细胞Eca-109细胞株购于上海市中科院细胞库，细胞在含10％小牛血清的RPMI 1640培养液中，37℃、5％CO2条件下培养，24 h换液1次。

1.2 试剂和仪器

RPMI-1640培养基购于武汉天源生物技术有限公司，为Gibco公司产品(货号31800-022)；超级新生牛血清为杭州四季青生物工程有限公司产品(批号050126)；实验用1∶250胰酶购于武汉天源生物技术有限公司，为Difco公司产品(批号020411)；四甲基偶氮唑蓝(MTT)购于武汉天源生物技术有限公司，为Duchefa分装(货号BS0880)；二甲亚砜(DMSO)购于武汉天源生物技术有限公司，为Sigma公司产品。Bax、Bcl-2及Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9相关蛋白均购于福州迈新生物技术有限公司。藤梨根正丁醇药液(以下简称藤梨根)由湖北医药学院药学部新药研制中心提供(500 ml，1 g/ml，pH=3.8)，使用时用RPMI 1640培养基稀释到1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml等药物浓度。酶标仪(美国Biotech公司Powerwave型)；CO2培养箱(德国Binder CB150型)；数码相机(日本尼康coolpix 4500型)；Motic 6.0 1 000高清晰度彩色病理图像分析系统(厦门麦克奥迪有限公司)。

1.3 MTT法

将贴壁细胞用0.25％的胰蛋白酶消化后计数，调整细胞浓度为4×104个/ml，接种于96孔板，待24 h细胞贴壁后加入藤梨根正丁醇药液。实验组分别加入终浓度为1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml等药物浓度的药液，对照组加入等体积溶剂的培养液，每组12复孔，分别于加药后第1、2、3 d等时间后测定各孔的吸光度值(A值)。测定前每孔加5 mg/ml的MTT 20 μl，温育4 h，弃上清液，加入二甲基亚砜(DMSO)150 μl/孔。同时振荡至结晶完全溶解，用酶联免疫检测仪在490 nm波长下测定A490值。用各组的平均A值计算细胞生长抑制率。

生长抑制率=对照组A490-实验组A490对照组A490×100％

1.4 免疫细胞化学SP法及图像分析

将浓度为4×104个/ml的Eca-109细胞接种于经多聚赖氨酸包被的清净盖玻片上，用RPMI 1640培养基于37℃、5％CO2条件下，在24孔板中培养24 h后取出盖玻片，PBS冲洗3次。0.1％Triton-100破膜﹑4％多聚甲醛固定，经H2O2阻断﹑血清封闭后，滴加50 μl一抗，PBS代替一抗作好阴性对照，4℃冰箱过夜。滴加生物素标记的二抗，PBS冲洗3次。滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，DAB显色。苏木精复染，盐酸分化，氨水返蓝，中性树胶封片。结果判断：每张细胞爬片随机选取5个不同部位，显微镜下拍照，用Motic 6.0高清晰度彩色病理图像分析系统对阳性细胞进行分析，测定阳性细胞的灰度值或光密度值。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 藤梨根对人食管癌Eca-109细胞生长的影响

藤梨根对人食管癌Eca-109细胞生长的影响见图1。结果显示，当用1 μg/ml的正丁醇提取物作用24 h，细胞生长抑制率为18.5％；当延长至72 h时，抑制率上升至45.3％ ；而用100 μg/ml的药物作用72 h时，可使85％以上的细胞生长受到抑制。结果表明，藤梨根对人食管癌Eca-109细胞的生长抑制作用，随着药物浓度的升高和作用时间的延长而增强。

图1 藤梨根对人食管癌Eca-109细胞生长抑制作用

2.2 藤梨根对人食管癌Eca-109细胞Bax及Bcl-2表达的影响

藤梨根对人食管癌Eca-109细胞Bax及Bcl-2表达的影响见图2、3。结果显示，藤梨根对肿瘤细胞作用24﹑48﹑72 h后分别与对照组比较，用药组Bax蛋白表达明显增强(P<0.01)，同时伴Bcl-2表达的改变；空白对照组细胞Bcl-2蛋白表达水平最高即平均灰度值最小，胞质着色的细胞数最多且呈深棕色。用药24 h后Bcl-2蛋白表达开始减弱，48 h后其表达量与对照组比较，差异有显著意义(P<0.05)，72 h后降低更为明显(P<0.01)。

2.3 藤梨根对Eca-109细胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表达的影响

藤梨根对Eca-109细胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表达的影响见表1。结果显示，用1 μg/ml藤梨根对肿瘤细胞作用24 h时，Caspase-8表达未见明显改变，Caspase-3、Caspase-9表达稍增强；作用48﹑72 h后，用药组Caspase-3、Caspase-9表达逐渐增强。100 μg/ml藤梨根作用72 h时，两组Caspase-3、Caspase-9表达均明显增强(P<0.01)。

图2 藤梨根对人食管癌Eca-109细胞Bax蛋白表达的作用

图3 藤梨根对人食管癌Eca-109细胞Bcl-2蛋白表达的作用

表1 藤梨根对人食管癌Eca-109细胞Caspase-8、Caspase-9及Caspase-12蛋白表达的作用(光密度,±s)

表1 藤梨根对人食管癌Eca-109细胞Caspase-8、Caspase-9及Caspase-12蛋白表达的作用(光密度,±s)

基因24h48h72hCaspase⁃8 1μg/ml0．100±0．0150．112±0．0110．121±0．014 10μg/ml0．114±0．0130．125±0．0160．126±0．011 100μg/ml0．115±0．0070．125±0．0170．138±0．020∗ 空白对照0．106±0．0130．116±0．0120．121±0．015Caspase⁃9 1μg/ml0．114±0．013∗0．134±0．021∗0．151±0．013∗ 10μg/ml0．145±0．015∗0．172±0．016∗0．197±0．009∗ 100μg/ml0．167±0．010∗0．201±0．012∗0．228±0．017∗ 空白对照0．100±0．0110．112±0．0130．120±0．016Caspase⁃3 1μg/ml0．104±0．0090．125±0．011∗0．146±0．015∗ 10μg/ml0．111±0．0130．135±0．020∗0．187±0．020∗ 100μg/ml0．115±0．0170．152±0．017∗0．217±0．014∗ 空白对照0．105±0．0100．115±0．0210．122±0．018

与对照组比较*为P<0.05；**为P<0.01

3 讨论

细胞凋亡是由基因编码控制的1种细胞的程序性死亡，是机体维持正常生理活动所必需的。近年发现，肿瘤的发生、发展不仅与细胞增殖有关，亦与细胞凋亡有关。凋亡基因精确调控凋亡过程。目前认为至少有3条通路参与凋亡的发生即传统信号传导通路、死亡受体通路( death receptor pathway)和线粒体通路(mitochondrial pathway)通路，各条通路间又有串话(cross talking)，共同促进细胞凋亡。3条凋亡通路最终都激活Caspase，但Caspase基因敲除实验表明细胞存在凋亡的代偿通路[5，6]。

近年来，研究发现Bcl-2家族及Caspase家族在介导细胞凋亡的线粒体通路中起着非常重要的作用[7～9]。部分研究显示藤梨根能增强肺组织促凋亡细胞因子如heme oxygenase-1、foxp3,TGF-β1等的表达，亦有报道显示能下调BCL-2：BAX mRNA的转录率[10，11]。本研究表明，藤梨根不同药物浓度1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml作用于Eca-109细胞24﹑48﹑72 h后，有明显的凋亡特征。MTT法检测到藤梨根能明显抑制Eca-109细胞的生长；免疫组化SP法检测Bax及Bcl-2蛋白的表达，与对照组比较用药组Bax蛋白表达增强，Bcl-2表达减弱；而同时伴有Caspase-3及Caspase-9蛋白表达明显增强。因此，我们推测诱导肿瘤细胞凋亡可能是藤梨根抗肿瘤作用的机制之一，它可能通过线粒体通路发挥作用。而研究中我们也观察到Caspase-8的轻度增强，这说明细胞凋亡并不完全是个线性通路，或者藤梨根同时启动了几种途径诱导细胞凋亡。

凋亡发生时BH - 3 only 亚族蛋白和Bax 亚族蛋白相互作用，促使Bax 亚族蛋白寡聚化，并进入线粒体，促使线粒体释放细胞色素c 和Smac/ DIABLO，细胞色素c 释放出来后，和凋亡蛋白酶激活因子(apoptotic protease activating factor,Apaf-1)结合，使Apaf-1寡聚化，激活procaspase- 9、 Caspase-9 激活下游的procaspase -3 及其它的executioner Caspase，引起凋亡。而死亡受体途径是通过激活FADD ，由死亡效应域(death effector domain ,DED)与procaspas 8 的前导区的DED 结合，激活procaspase 8。随后Caspase-8 又激活下游的procaspase3 及其他Caspase 家族的executioner Caspase，引起凋亡。

细胞凋亡中信号分子间相互影响，构成了细胞凋亡的环形通路—死亡环[12]。在这个死亡环里，Caspase、Bcl-2 、细胞色素相互作用：细胞色素能激活procaspase ，而有活性的Caspase 也能刺激线粒体释放细胞色素C。这样，上游分子和下游分子的凋亡信号呈级联放大效应。而Bcl-2 既能在细胞色素上游，也能在其下游发挥作用。阻断这种环形放大的级联效应，从而有效的抑制细胞凋亡。

本研究显示，藤梨根诱导Eca-109细胞凋亡中线粒体介导的内部凋亡通路中的上游关键酶Caspase-9和下游的效应分子Caspase-3均被激活，而且Caspase-3的激活伴随Casapase-9的活化，这不仅提供了藤梨根诱导Eca-109细胞凋亡作用的基础资料，而且为食管癌的防治提供了新的线索。

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