虾夷扇贝雌雄同体自体受精繁殖生物学的研究＊

于瑞海，王昭萍，赵雪琳，孔 静，张志强，许瑞平，范立强

（1.中国海洋大学水产学院，山东青岛266003；2.山东海益宝水产有限公司，山东烟台265100）

虾夷扇贝雌雄同体自体受精繁殖生物学的研究＊

于瑞海1，王昭萍1，赵雪琳1，孔 静1，张志强1，许瑞平1，范立强2

（1.中国海洋大学水产学院，山东青岛266003；2.山东海益宝水产有限公司，山东烟台265100）

本文以虾夷扇贝的雌雄同体个体为实验材料，对成熟个体的性腺进行组织切片观察，并通过对雌雄同体自体受精、早期胚胎发育和幼虫培养的研究，发现虾夷扇贝自体繁殖的产卵量、受精率和卵裂率与对照组没有很大差异，但是其孵化率和畸形率有明显差异分别为82%和17.3%，而对照组为90%和9.6%；幼虫培育期间的生长没有明显差异，但成活率差异极明显为4%，而对照组为40%。

虾夷扇贝；雌雄同体；自体受精；胚胎发育；幼体培育

虾夷扇贝（Patinopecten yessoensis）原产于日本和朝鲜，现已引进我国，因个体大，闭壳肌肥大，味道鲜美，营养价值高，生长快，经济效益好，深受广大消费者和养殖单位欢迎，现已在山东、辽宁等北方沿海进行大面积的人工养殖和底播增殖生产［1－2］。近几年虾夷扇贝养殖出现的大量死亡问题，给养殖企业造成一定的经济损失，一定程度上与种质的退化有关［3］。

近年来，在进行虾夷扇贝人工育苗的过程中，发现养殖的成贝中存在着大量雌雄同体的个体，经粗略统计，2006年5%～6%，而2007年为8%～9%，2008—2009年在10%以上，最高可达18%。针对这一现象，作者在2010年春季进行了利用虾夷扇贝的雌雄同体个体开展繁殖生物学研究，探讨其能否进行自体受精发育、自交后代能否正常生长，为研究虾夷扇贝死亡原因以及选种和杂交育种提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 亲贝于2010年1月从大连购进，在烟台海益宝水产有限公司亲贝培育车间暂养1个月。性腺肥满度达25%以上时即可进行产卵。在亲贝暂养池选取雌雄同体的虾夷扇贝3只，壳高12 cm以上，性腺饱满度好，外型规则，活力好，其中1只进行组织切片观察。再选取性腺饱满度好的正常的雌雄异体的雌贝2只，性腺发育好的雄贝2只。

1.1.2 育苗器材 50 L的白色塑料桶6个，换水滤鼓、育苗器材等，管理按虾夷扇贝的人工育苗正常操作进行。

1.1.3 性腺组织切片 进行性腺组织切片所需要的药品、切片机、显微照相等仪器。

1.2 方法

1.2.1 虾夷扇贝雌雄同体性腺组织切片 对取得虾夷扇贝雌雄同体进行解剖、观察，并将切取的一部分性腺组织用波恩（Bouin）氏液固定，石蜡包埋切片（切片厚度5μm），苏木精－伊红（H－E）染色。显微镜下观察虾夷扇贝雌雄同体性腺结构状况。显微镜观察（Olympus BX50，日本）、拍照（Olympus DP70，日本）。

1.2.2 实验设计

1.2.2.1 繁殖生物学实验 2个雌雄同体个体分别编号A、B；2个雌贝编号C、D；2个雄贝则编号为E、F。从受精率、卵裂率、孵化率等繁殖生物学指标对比分析。

1.2.2.2 幼虫培育实验 主要设计雌雄同体虾夷扇贝组，取平行的3组，编号为1、2、3，其中1是A个体、2是B个体，3是从1和2中取出等体积的受精卵混合在一起。雌雄异体虾夷扇贝（虾夷♀×虾夷♂）的对比编号为4、5、6，幼虫生长速度、成活率、附着变态率等各方面的生长性状来进行对比分析。

1.2.3 亲贝的产卵与受精 把A、B、C、D、E、F编号的种贝进行阴干处理1 h后，分别放入相应编号的50 L的白色塑料桶内在桶中，加入13℃的过滤海水，微量充气进行产卵、排精。按预先设计方案，及时完成对各实验组人工授精，对于精子过多的实验组，要进行洗卵，显微镜检每个卵子周围有4～5个精子为宜。

1.2.4 虾夷扇贝雌雄同体组的胚胎发育观察 虾夷扇贝的受精卵属沉性卵，需经常进行搅动，其胚胎发育的水温是13℃。在孵化期间每隔20 min进行1次显微镜观察，记录胚胎发育情况。

1.2.5 幼虫培育阶段的管理

1.2.5.1 选优 发育到D形幼虫时，用300目网箱及时选出。幼虫培育密度为5～6个／m L，幼虫培育编号

1、2、3 为雌雄同体组，4、5、6为正常的对照组。

1.2.5.2 幼虫管理

（1）投饵

刚孵化出来的幼虫开口饵料为金藻，中、后期后又增加扁藻等，投饵量应根据幼虫摄食情况确定，每天投饵4次。

（2）换水与充气

每日换水2次。每次换水量1／3～1／2。不间断微量充气。

（3）测量和观察

每天显微镜观察幼虫的生长情况，测量幼虫的大小和成活率记录，以确定其生长速度和成活率。

1.2.6 各种参数的计算

受精率＝［受精卵（已排第一极体）÷总卵数］×100%

卵裂率＝［已分裂的受精卵÷（受精卵）］×100%

D形幼虫孵化率＝［D形幼虫÷（受精卵）］×100%

幼虫成活率＝幼虫成活的最后密度÷原始的密度×100%

2 结果与分析

2.1 虾夷扇贝雌雄同体性腺组织切片观察

通过石蜡包埋组织切片观察，其性腺结构见图1 a、b、c所示。

图1 虾夷扇贝雌雄同体个体和对照组性腺切片比较Fig.1 Slice images of germen of hermaphrodite Patinopecten yessoensis and the control group's

2.2 虾夷扇贝雌雄同体胚胎发育时序

从受精卵胚胎发育阶段开始定时进行记录，并与正常的虾夷扇贝受精卵发育进行对比分析。以授精时间为起始时刻，记录胚胎发育时间（min），具体见表1。

表1 雌雄同体自交个体和雌雄异体发育后代的比较Table 1 Comparison of offspring of self－fertilization of hermaphrodite Patinopecten yessoensis and the dioecism／min

通过观察，雌雄同体虾夷扇贝自体受精的胚胎发育比雌雄异体受精在2细胞期发育快，在4细胞期以后胚胎发育稍慢些，约0.5 h，但总体上来看，二者差别不大，可认为胚胎发育是同步的。

2.3 虾夷扇贝雌雄同体与对照组在产卵量、受精率、卵裂率、孵化率、畸形率上的比较

经连续的测量和计数，虾夷扇贝雌雄同体与对照组在产卵量、受精率、卵裂率、孵化率、畸形率上的比较结果见表2。

表2 虾夷扇贝雌雄同体受精发育情况变化比较Table 2 Comparison of self－fertilization of hermaphrodite Patinopecten yessoensis and the control group's

由于实验所用虾夷扇贝已经产过1次卵，所以产卵时产卵量不是太大，正常应在1 000万粒以上，通过以上数据的方差分析，得出P＞0.05，可知道雌雄同体虾夷扇贝自交组与对照组二者没有区别。但在孵化率和畸形率方面虾夷扇贝雌雄同体自交组和对照组相比有比较大的差异。

2.4 虾夷扇贝雌雄同体实验组与正常对照组生长发育情况比较

2.4.1 虾夷扇贝雌雄同体幼虫生长比较 把刚选优出的幼虫，在相同培育条件下，虾夷扇贝雌雄同体实验组和正常的虾夷扇贝雌雄异体对照组幼虫，每2 d测量1次，每次测量10个幼体，实验有2组平行组，求出其平均大小，并根据其生长成活情况，经常调整其密度，保持其幼虫培育密度一致，壳长生长情况见图2。

图2 虾夷扇贝雌雄同体自交幼虫组和对照组生长比较Fig.2 Comparison of shell height of self－fertilization of hermaphrodite Patinopecten yessoensis and the control group's at larvae stage

从图上可看出，二者在生长发育速度上没有差别，而且幼虫生长情况、摄食情况跟正常的对照组幼虫没有差异。

2.4.2 虾夷扇贝雌雄同体幼虫成活率比较 把刚选优出的幼虫，在相同培育条件下，虾夷扇贝雌雄同体实验组和正常的虾夷扇贝雌雄异体对照组幼虫，每2 d测量1次密度，实验有2组平行组，求出其平均密度，并根据其生长成活情况，经常调整其密度，保持其幼虫培育密度一致，至投附着基期间成活变化情况见图3，其最终的成活率见图4。

从图3和图4可以看出，虾夷扇贝雌雄同体实验组的幼虫与对照组二者在存活率方面，差异明显，雌雄同体自交组成活率仅为4%，而对照组是40%。实验组幼虫培育至160μm幼虫成活率降幅最大，死亡率在90%以上，160μm以后基本上稳定。

图3 虾夷扇贝雌雄同体自交幼虫组和对照组存活情况比较Fig.3 Comparison of the change of the survival rate of selffertilization of hermaphrodite Patinopecten yessoensis and the control group's at larvae stage

图4 虾夷扇贝雌雄同体自交幼虫组和对照组成活率比较Fig.4 Comparison of survival rates of the larvae of self－fertilization of hermaphrodite Patinopecten yessoensis and the control group's

3 讨论

3.1 虾夷扇贝雌雄同体性腺组织结构类型

通过组织切片观察虾夷扇贝雌雄同体的性腺组织，在所观察的个体中存在2种结构，一种是卵细胞和精细胞在同一滤泡中，另一种是卵细胞和精细胞分属2个滤泡中，但都属于在性腺组织腹嵴的上，可以通过外观颜色观察到，这与王梅芳［4］在2种江珧中发现的雌雄同体的2种情况相似，但与王梅芳［5］在马氏珠母贝中发现的雌雄同体中存在的2种情况不同，这可能是与品种不同造成，也可能与解剖观察的数量不足有关。

3.2 虾夷扇贝雌雄同体自体受精发育与正常受精发育上的差异分析

虾夷扇贝雌雄同体自体受精发育和正常的个体受精发育相比虽然可以进行，并且在受精率、卵裂率、孵化率等方面没有显著差异，但是在畸形率方面存在较大差异，明显低于正常对照组。而在幼体生长发育方面生长速度差异不明显，但在幼虫成活率方面差异明显，明显低于的对照组，这种差异也许是由于雌雄同体亲本的配子自交导致近亲繁殖，造成幼虫体质差，成活率降低的原因之一，具体造成雌雄同体比例增多的原因是否与种质退化有关还是与环境有关有待于进步一研究。

3.3 虾夷扇贝雌雄同体自体受精繁殖的生物学意义

虾夷扇贝雌雄同体自体受精后代虽然在成活率方面较低，但在生长上和对照组没有明显区别，并能正常发育、附着变态，培育至幼苗，这为虾夷扇贝的选择和杂交育种打下了坚实基础。从理论上讲，同一个体精、卵结合，其后代中基因纯化速率最快，自体受精是近亲繁殖中亲缘关系最近的交配方式，因此，用自体受精的方法来产生高纯度的个体比用其他近交方法要快的多［6－7］。目前张国范、郑怀平和张海滨等［8－11］利用雌雄同体的海湾扇贝已进行了自交家系的建立和生长等方面的研究，显示出该途径对海湾扇贝有较大的育种价值。刘晓也开展了利用雌雄同体的虾夷扇贝自体受精建立自交系的研究，见中国专利（刘晓等，一种雌雄异体型贝类自交系的建立方法，国家发明专利，授权时间：2006，专利号：ZL200410050568.0）［13］。

目前，我国进行养殖的扇贝基本上都是没有经过系统的人工选育，其遗传基础是野生型的，生长速度，抗逆能力乃至品质质量［12］，都需要经过系统的人工选育而加以改进，进行这方面的探索对于保证扇贝养殖业的可持续发展，进行扇贝的遗传育种改良，增加贝类的遗传多样性，以期对扇贝的遗传育种工作提供一定的理论基础。根据优良品种选育理论，要使优良性状的基因纯化，从而将性状稳定地遗传给后代，是几乎所有优良品种培育必经的过程。而这个过程通常是采用具有亲缘关系的亲本多代近交的方法来实现［6，14］。由于贝类易受寿命短、性成熟年龄、每年的繁殖季节等限制，良种培育往往要经过五代以上的选育才能获得。因此，如何使初选亲本的种质纯化并稳定下来是非常关键的工作，可以利用虾夷扇贝雌雄同体自体受精繁殖后代的基因纯合度高，易于快速选育高纯合度品系的特点，选择优良个体进行了连续自交培育，以其培育出性状优良虾夷扇贝新品种，促进虾夷扇贝增养殖业健康稳定的可持续发展。虽然虾夷扇贝雌雄同体自体受精后代成活率较低，但由于虾夷扇贝产卵量较大，其成活的数量可以满足生产上选种的需要，从而为虾夷扇贝的选择和杂交育种提供很好的实验材料。

［1］ 张福绥，何义朝，马江虎，等.虾夷扇贝的引种、育苗及试养［J］.海洋科学，1984，1（5）：38－45.

［2］ 王庆成.虾夷扇贝的引进及其在我国北方增养殖的前景［J］.水产科学，1984，3（4）：24－27.

［3］ 张明明，赵文.我国虾夷扇贝死亡原因的探讨及控制对策［J］.中国水产，2008（2）：65－66，74.

［4］ 王梅芳，余祥勇，王君彦.两种江珧雌雄同体及性转换现象［J］.湛江海洋大学报，1999，19（4）：6－11.

［5］ 王梅芳，余祥勇，刘永，等.马氏珠母贝雌雄同体和自体受精的研究［J］.水生生物学报，2006，30（4）：420－424.

［6］ 刘少军，姚占州，刘筠.能自体受精的雌雄同体黄边胡鲇的性腺结构研究［J］.水生生物学报，1995，19（1）：92－93.

［7］ 刘少军，王跃群，姚占州.人工诱导雌雄同体革胡子鲇自体受精后代的胚胎发育的研究［J］.中国水产科学，1997，4（2）：7－12.

［8］ 张国范，刘述锡，刘晓，等.海湾扇贝自交家系的建立和自交效应［J］.中国水产科学，2003，10（6）：441－445.

［9］ 郑怀平，张国范，刘晓，等.海湾扇贝杂交家系与自交家系生长和存活的比较［J］.水产学报，2004，28（3）：267－272.

［10］ 郑怀平，张国范，刘晓，等.不同贝壳颜色海湾扇贝（Argopecten irradians）家系的建立及生长发育研究［J］.海洋与湖沼，2003，34（6）：632－639.

［11］ 张海滨，刘晓，张国范，等.不同有效繁殖群体数对海湾扇贝F1生长和存活的影响［J］.海洋学报，2005，27（2）：177－180.

［12］ 潘瑛，李琪，王如才，等.海洋贝类雌核发育研究进展和展望［J］.水产学报，2002，26（5）：465－471.

［13］ 刘晓，张国范.一种雌雄异体型贝类自交系的建立方法［P］.国家发明专利，2006，ZL200410050568.0）.

［14］ 范兆廷.水产动物育种学［M］.北京：中国农业出版社，2005：241－242.

Reproductive Biology of Self Fertilization in Hermaphrodite Japanese Scallops（Patinopecten yessoensis）

YU Rui－Hai1，WANG Zhao－Ping1，ZHAO Xue－Lin1，KONG Jing1，ZHANG Zhi－Qiang1，XU Rui－Ping1，FAN Li－Qiang2
（1.College of Fisheries，Ocean University of China，Qindao 266003，China；2.Shangdong Haiyibao Aquatic Products Co.，LTD，Yantai 265100，China）

On basis of observation on gonad samples from embryo and larvae obtained by self－fertilization of hermaphrodite Patinopecten yessoensis，the results showed that the difference in ova number，rate of fertilization and cleavage rate of self－fertilization of hermaphrodite was not significant compared with the dioecism.But the difference in hatching and abnormality rate was significant between them.The hatching and abnormality rate of larvae were obtained by self－fertilization were 82%and 17.3%，and the control group's were 90%and 9.6%.The growth of the larvae obtained by self－fertilization was almost the same as the control group's.But the difference in survival rate was significant between them，the survival rate was 4%and 40%respectively.

Patinopecten yessoensis；hermaphrodite；self－fertilization；embryonic development；larval breeding

S917

A

1672－5174（2011）11－023－05

国家高技术研究发展计划项目（2006AA10A401）；国家科技基础条件平台项目（2005DKA30470）资助

2010－12－20；

2011－03－24

于瑞海（1964－），男，高级工程师，主要从事贝类育种研究。E－mail：yuruihai＠ouc.edu.cn

责任编辑 王 莉