溶磷和pH值对杀真菌素链霉菌合成恩拉霉素的影响

刘铁军,李 炯

(河北圣雪大成制药有限责任公司,河北石家庄 051430)

溶磷和pH值对杀真菌素链霉菌合成恩拉霉素的影响

刘铁军,李 炯

(河北圣雪大成制药有限责任公司,河北石家庄 051430)

研究了培养基灭菌后溶磷和发酵过程pH值等对杀真菌素链霉菌(Streptomyces fungicidicus)J Z-14-056D3合成恩拉霉素的影响,通过发酵尾气成分的测量和OUR,DO等参数的分析,发现培养基灭菌后溶磷质量浓度控制在0.65μg/mL,控制发酵过程pH值为7.0,192 h发酵单位最高可达5 710 U/mL。

恩拉霉素;发酵;pH值;溶磷

恩拉霉素(enramycin)又名持久霉素(enduracidin),是杀真菌素链霉菌(Streptomyces fungicidicus)发酵得到的由一个不饱和脂肪酸与十几种氨基酸结合的多肽类畜用抗生素,主要组分有恩拉霉素A和B(两者的比例约为7∶3)。该抗生素于1966年由日本武田药品工业株式会社研发,1974年在日本正式注册,其后在许多国家被注册和广泛使用[1]。它对革兰氏阳性菌有很强的抑制作用,特别对肠道有害菌梭菌的抑制作用较强,长期使用后不易产生耐药性。它能改变肠道内的细菌群落分布,有利于饲料营养成分的消化吸收,促进动物增重和提高饲料利用率,因此被世界上许多国家推荐作为抗生素促生长剂。

磷酸盐是微生物氧化磷酸化反应底物,对微生物的生长与初级代谢起着重要作用。但在次级代谢产物的生产中,所需要的磷酸盐浓度较低,平均浓度仅为1.0 mmol/L,提高至10 mmol/L就会明显抑制次级代谢产物的合成[2]。

发酵培养基的pH值对微生物生长和代谢也具有非常明显的影响[3]。不同微生物的生长和产物合成各有其适合的pH值范围。

发酵过程的摄氧率(OUR)及溶氧(DO)是微生物细胞生长与代谢强度的度量,是分析和控制发酵过程的重要指标。

本研究通过利用气体质谱仪分析发酵过程中尾气CO2和O2等浓度的变化,计算和分析发酵过程的OUR,并结合DO和菌浓变化,系统优化控制发酵过程,使发酵产量有了一定程度的提高。

1 材料与方法

1.1 菌种

杀真菌素链霉菌(Streptomyces fungicidicus)JZ-14-056D3,为河北圣雪大成制药有限责任公司自选菌种。

1.2 培养基

种子罐培养基(均以质量浓度表示):玉米粉10 g/L,淀粉 20 g/L,大豆油 3 g/L,硫酸铵 2.5 g/L,KH2PO40.9 g/L,泡敌 0.04 g/L 。

发酵罐培养基(均以质量浓度表示):葡萄糖40 g/L,玉米粉40 g/L,玉米蛋白粉25 g/L,棉籽饼粉10 g/L,硫酸铵17.8 g/L,泡敌0.04 g/L。

发酵补料培养基:40%(质量分数)淀粉溶液。

1.3 培养条件

种子罐:温度为(30±0.5)℃;培养时间为24 h;罐压为0.02 MPa;通气比为1∶1;转速为600 r/min;接种量为1.5%(体积分数);种子罐体积为15 L;装液量为70%(体积分数)。

发酵罐:温度为(30±0.5)℃;培养时间为180 h;罐压为0.02 MPa;通气比为1∶1;转速在600 r/min以内,根据溶氧状况进行调节;接种量为10%(体积分数);发酵罐体积为50 L;装液量为70%(体积分数)。

当种子罐培菌浓不低于25%(体积分数),pH值持续下降,镜检菌丝为舒展网状,将种子以压差法移入发酵罐进行培养。发酵罐灭菌后培养基总糖为73～76 g/L,50 h后通过补料控制总糖为15～25 g/L。

1.4 分析方法

1.4.1 效价测定

单独采用HPLC法测定发酵液效价。流动相:0.05 mol/L的乙腈与磷酸二氢钠体积比为3∶7,用磷酸调pH值至4.5。采用色谱柱waters C18,流速为1.0 mL/min,进样量为20μL,检测波长为267 nm,运行时间为20 min。

1.4.2 化学分析

溶磷采用钼酸比色法[4],总糖采用菲林法[5]进行分析测定。

1.4.3 发酵尾气分析

采用质谱仪采集发酵过程尾气,分析 O2和CO2等的变化,计算OUR。

2 所用仪器设备

15 L,50 L发酵罐为扬中威柯特生物工程设备公司提供;气体质谱仪为英国海登公司提供的HPR20型质谱仪;液相色谱仪为Cometro 6000高效液相色谱系统。

3 试验内容

3.1 灭菌后溶磷

根据基础培养基中 KH2PO4添加量,灭菌后将溶磷质量浓度分别控制在0.20,0.65,0.95,1.50 μg/mL共4个梯度。

3.2 pH值控制梯度

通过加入不同量的氨水,分别将发酵过程的pH值控制在6.5,6.8,7.0和7.2共4个梯度。

4 结果与讨论

4.1 灭菌后溶磷浓度(以质量浓度计,下同)的确定

4.1.1 不同灭菌后溶磷浓度下的DO,OUR和效价(考察前50 h)(见图1和表1)

图1 灭菌后不同溶磷浓度下DO和OUR变化曲线Fig.1 Dissolved oxygen and OUR curve in different dissolved phosphate concentrations after sterilization

表1 灭菌后不同溶磷浓度下起步效价表Tab.1 Initial titer in different dissolved phosphate concentrations after sterilization

从图1(其中,数字代表灭菌后不同溶磷质量浓度:1为0.20μg/mL;2为 0.65μg/mL;3为0.95 μg/mL;4为1.50μg/mL)和表1中可以看出,随着培养基灭菌后溶磷浓度的提高,发酵过程中DO下降加快,OUR也随之快速提高,但是当灭菌后溶磷质量浓度为0.95μg/mL和 1.50μg/mL时出现DO继续下降至20%以下,而OUR也随之下降的现象,出现OUR和DO同时下降,及DO已经低于临界氧浓度以下,导致OUR下降[6],也就是说需要控制的临界氧浓度不能低于20%。同时结合效价可知,高的灭菌后溶磷浓度可以提高起步效价,但是效价涨幅在0.65μg/mL时最大,这就说明虽然高的灭菌后溶磷浓度虽然能较快消耗DO,提高起步效价,但是由于DO很快达到临界值以下,使得发酵效价并没有相应提高。

4.1.2 灭菌后不同溶磷浓度下的糖耗变化(见图2)

图2 灭菌后不同溶磷浓度的总糖变化曲线Fig.2 Total sugar curve in different dissolved phosphate concentrations after sterilization

图2中,数字代表灭菌后不同溶磷质量浓度:1为0.20μg/mL;2为 0.65μg/mL;3为 0.95μg/mL;4为1.50μg/mL。

由图2可以看出在灭菌后不同溶磷浓度下均在10 h出现总糖的消耗,但是随着灭菌后溶磷浓度的提高耗糖快速期也随着提前:当灭菌后溶磷浓度在0.20μg/mL时,总糖50 h下降到25 g/L;当灭菌后溶磷浓度在0.65μg/mL时,总糖40 h下降到25 g/L;当灭菌后溶磷浓度在0.95μg/mL时,总糖40 h下降到18 g/L,之后变化不大;当灭菌后溶磷浓度在1.50μg/mL时,总糖40 h达到17 g/L,之后变化不大。但当DO低于20%时糖耗速率也随之下降。

4.2 发酵过程pH值的控制

发酵过程中pH值持续下降,但合成恩拉霉素需要一个合适的pH值范围,因此在40 h后通入氨水对pH值加以调控,保证恩拉霉素的合成。

4.2.1 不同pH值下的溶氧变化(见图3)

图3 不同pH值下DO变化曲线Fig.3 DO curve in different pH

由图3可知,在加入氨水控制pH值之前DO变化基本相同,但在此之后DO出现不同变化:当pH值控制在6.5时DO高于其他条件下的DO值达30%以上;当pH值为7.0时DO为最低,基本在20%左右;当pH值在6.8和7.2时,DO基本相同,维持在25%左右。

4.2.2 不同pH值下OUR变化(见图4)

图4 不同pH值下OUR曲线Fig.4 OUR curve in different pH

由图4可以看到,pH值为6.5时,产物积累期菌体的OUR水平较低,发酵后期菌体OUR下降速度快;pH值在6.8和7.2时,产物积累期的OUR比较平稳,后期下降平缓;而pH值在7.0时上升速度快,产物积累的OUR高且平稳,发酵后期菌体OUR则有所下降。由此可见,pH值水平控制在7.0时,有利于菌体维持适当的活力。

4.2.3 不同pH值下效价变化(见图5)

48 h不测放罐效价,图5中取值为0。由图5可以发现,在开始通氨水时并不影响发酵单位,起步效价基本相同,均在250～260 U/mL左右,但是pH值持续控制之后,效价增长幅度明显拉开,当pH值为6.5时效价涨幅最慢,每24 h基本维持800 U/mL,放罐效价较低;当pH值控制在7.0时效价涨幅最高,每24 h达到1 200 U/mL,放罐效价最高;当pH值控制在6.8和7.2时,都相对较高,但是pH值在7.2时的效价涨幅要高于pH值在6.8时,因此确定pH值控制在7.0～7.2为宜。

图5 不同pH值时的效价曲线Fig.5 Titer curve in different pH values

5 结 论

对杀真菌素链霉菌(Streptomyces fungicidicus)JZ-14-056D3在不同溶磷质量浓度和pH值下菌体的代谢活性(OUR和DO变化)和效价增长情况进行了考察。菌体在初始溶磷质量浓度为0.65 μg/mL,发酵过程pH值控制在7.0～7.2,DO≥20%时,恩拉霉素的合成水平最高,为5 710 U/mL。从试验结果可以看出,pH值和溶磷质量浓度的变化对恩拉霉素的合成有着较为显著的影响。

随着溶磷质量浓度的升高DO下降速率加快,菌体的初始代谢活性增强(表现为随着溶磷质量浓度的提高,OUR逐渐上升),菌体在更短的时间内积累大量的前体物,为后期发酵效价的产生提供了足够的生物量,这有利于生产期恩拉霉素的大量合成。但随着生物量的提高,发酵过程临界氧浓度出现的时间提前,并且持续时间更长,这种情况造成了菌体代谢途径的改变,发生了代谢异常,阻碍了恩拉霉素的合成效率。因而,初始溶磷质量浓度的控制对于抗生素的产生起着重要的作用。

发酵液pH值的变化影响着菌体的生长和抗生素合成相关酶类的活性,因而,菌体生长的最适宜pH值和抗生素合成的最适宜pH值不一定相同。通过对菌体代谢活性和抗生素产生情况的考察,发现发酵液的pH值维持在7.0时菌体的代谢活性和效价产生速率均达到了最高,这表明菌体的初级和次级代谢的最适宜pH值相同。

[1]周岷江,严玉宝,胡 娟,等.恩拉霉素的研究进展[J].中国兽药杂志,2007,41(12):42-44.

[2]白秀峰.发酵工艺学[M].北京:中国医药科技出版社,2003.

[3]熊宗贵.发酵工艺原理[M].北京:中国医药科技出版社,1995.

[4]GB/T 5009.87—2003,食品中磷的测定[S].

[5]张龙翔.生化实验方法和技术[M].北京:人民教育出版社,1982.

[6]张嗣良,储 炬.多尺度微生物过程优化[M].北京:化学工业出版社,2003.

Investigation for effects of dissolved phosphate and pH on producing enramycin byStreptomyces fungicidicusJZ-14-056D3

LIU Tie-jun,LI Jiong
(Hebei Shengxue Dacheng Pharmaceutical Company Limited,Shijiazhuang Hebei 051430,China)

This paper investigated the effects of dissolved phosphate concentration and pH in the fermentation medium after sterilization on the production of enramycin byStreptomyces fungicidicusJZ-14-056D3.Through the assaying of off-gas and analysis of OUR and DO,it is found that the yield of enramycin can reach 5 710 U/mL in 192 h when the dissolved phosphate concentration in the medium is 0.65μg/mL and the pH is 7.0.

enramycin;fermentastion;pH values;dissolved phosphate

TQ465.6

A

1008-1534(2011)04-0233-03

2011-03-23;

2011-04-06

责任编辑:王海云

刘铁军(1970-),男,河南南阳人,高级工程师,主要从事抗生素发酵方面的研究。