漆酶在Fe3O4/SiO2表面的固定化及其性质研究

徐璐璐，魏冬雪，王红霞

(哈尔滨师范大学)

漆酶在Fe3O4/SiO2表面的固定化及其性质研究

徐璐璐，魏冬雪，王红霞

(哈尔滨师范大学)

采用共价－偶联法，在较温和的条件下进行漆酶在Fe3O4/SiO2载体上的固定化研究，利用TEM、FTIR、UV－vis和VSM等手段对固定化漆酶进行表征并考察其酶学性质.结果表明，漆酶在Fe3O4/SiO2载体上固载之后，其最适pH和温度变化不大，但操作稳定性和分离性能都有明显改善，以ABTS为底物，固定化漆酶在重复使用10次后，酶活仍能保持在初始酶活的85%以上，反应之后的漆酶可以通过外加磁场快速分离.

漆酶;固定化;Fe3O4/SiO2

0 引言

漆酶是一类含铜的氧化还原酶，其对酚类及芳香类化合物的优良降解能力引起了人们的广泛关注［1－7］，尤其是当有可起氧化还原作用的介体存在时［8－10］，漆酶可氧化的底物范围进一步扩大，偶氮类和靛青类等非漆酶底物染料此时也可以得到有效降解，这一特点使漆酶在工业染料降解方面显示了重要的应用价值.

然而，由于游离漆酶难于回收，漆酶的固定化成为研究热点.磁性材料作为漆酶的一种固定化载体［11－12，15］，对实现漆酶的快速分离和保持较高的操作稳定性十分有利［13－17］.Huang 等［13］利用磁性壳聚糖固定化漆酶，固定化的漆酶具有磁可分性能，将其用于氧化底物ABTS，在循环使用10次以后漆酶的酶活仍然维持在初始酶活的80%以上;Salis等［14］利用磁性的SBA－15固定化漆酶，循环氧化原儿茶酸，使用14次以后原儿茶酸的转化率仍能达到60%;Zhu等［15］利用磁性的中孔SiO2微球固定化漆酶，在氧化底物ABTS的循环试验中，发现循环使用10次以后的酶活仍能维持在初始酶活的70%以上;Liu等［16］利用磁性的SiO2粒子固定化漆酶，并进行氧化邻苯二酚的试验，发现在循环使用10次以后固定化漆酶的酶活仍然保持在初始酶活的50%.在这些研究中，漆酶的固定化基本都是以戊二醛为交联剂实现的，利用戊二醛上的醛基分别与漆酶和磁性载体表面的氨基键合，因此磁性载体表面的氨基修饰非常重要.在已有文献［14－16，18］的报道中，载体表面的氨基修饰多是在甲苯或甘油为溶剂、60～120℃的回流条件下完成.本文探索在室温、乙醇/水为溶剂的较温和条件下进行Fe3O4/SiO2载体表面的氨基修饰和以戊二醛为交联剂的漆酶固定化，随后考察固定化漆酶的酶学性质，结果表明漆酶固载成功，并且具有很好的操作稳定性和磁分离性能.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

氯化亚铁(FeCl2·4H2O)、三氯化铁(FeCl3·6H2O)，正硅酸乙酯(TEOS)，异丙醇，2，2'－连氮－双(3－乙基并噻 －6－磺酸)(ABTS，Sigma)，漆酶(Sigma－Aldrich)，3－氨基丙基三乙氧基硅烷(APS)，戊二醛(天津市科密欧化学试剂中心).

1.2 固定化漆酶的制备

磁性Fe3O4/SiO2载体的制备参见文献［19］.取100 mg Fe3O4/SiO2分散于50 mL 乙醇中，超声分散，再加入5 mL去离子水和0.2 mL APS，在室温下搅拌12 h，反应结束后水洗、磁分，得到氨基修饰的Fe3O4/SiO2载体(标记为Fe3O4/SiO2－NH2).向Fe3O4/SiO2－NH2中加入适量的戊二醛，在室温下缓慢搅拌3 h，水洗、磁分，标记为Fe3O4/SiO2－NH2－GA，保存于磷酸缓冲液中备用;取适量漆酶溶解在pH=7的磷酸缓冲液中，并加入 Fe3O4/SiO2－NH2－GA，室温下搅拌12 h，漆酶固定化完成，多次水洗、磁分，直至上清液中检测不到蛋白质为止，固定化漆酶标记为E－Fe3O4/SiO2－NH2－GA，在缓冲液中4℃保存备用.

1.3 固定化漆酶的表征及酶学性质考察

采用日立H－7650型透射电子显微镜(加速电压100kV)观察漆酶固定化前后载体的形貌和尺寸;FTIR测试采用Bruker V80傅里叶红外仪完成，扫描范围400～4000 cm－1;采用美国Lake shore 7410型振动样品磁强计进行样品磁滞回线(M－H)测试.

采用考马斯亮蓝染色法在595 nm下测定蛋白质的含量，通过标准工作曲线的绘制衡量漆酶在载体上的固载量［20］;以ABTS为漆酶底物，采用PerkinElmer Lambda 45 UV/Vis分光光度计在420 nm下测定漆酶活力.以每分钟氧化1 μmol的ABTS所需要的酶量定义为1个酶活力单位(U)［21］.固定化漆酶酶活回收率R(%)的计算公式为

式中，Ai是固定化酶的酶活(U)，Af是与固定化酶等量的游离酶的酶活(U).

图1 载体和固定化漆酶的TEM照片

图2 样品的红外谱图

2 结果与讨论

2.1 固定化漆酶的结构表征

图1为Fe3O4/SiO2载体和固定化漆酶E－Fe3O4/SiO2－NH2－GA的 TEM 照片.图1a显示Fe3O4/SiO2载体具有明显的“核 －壳”结构，而且分散状态较好，与文献［19］报道的结果相一致;在图1b中，载体聚集的程度明显增加，这可能是负载漆酶的结果.进一步对样品进行FTIR测试，结果如图 2所示.在曲线 a上，580 cm－1处的振动峰归属于Fe3O4粒子的特征Fe － O 振动［22－25］，1630 cm－1和 3400 cm－1处的振动峰分别对应于O－H的弯曲振动和伸缩振动［22－23］;在曲线 b上，除了 Fe － O 振动之外，在461 cm－1、1080 cm－1处还新出现了 Si－O －Si的弯曲振动和反对称伸缩振动［19，22］，960 cm－1处出现了Si－OH的对称伸缩振动，说明载体Fe3O4/SiO2已经形成;相比于曲线 b，曲线 c上位于2850 cm－1和 2930 cm－1处的对称和反对称的C—H伸 缩 振 动 峰［13，22］明 显 增 强，而 且 在1465 cm－1处出现了一个小的 N—H 振动峰［14］，这是由于氨基修饰剂 APS上存在—C2H5和—NH2基团，这一结果表明氨基在Fe3O4/SiO2载体表面的成功修饰;进行戊二醛活化后，曲线d上 N －H 弯曲振动峰和2850 cm－1、2930 cm－1处的C—H键振动峰明显减弱，同时可见1740 cm－1处游离的 H － C=O 振动峰［26］，说明—NH2与部分 H—C=O发生作用，由于—C=N—振动(1647cm－1)［14］与 O—H 振动位于同一范围，因此无法严格区分;相对于曲线d，曲线e(固定化漆酶后)上1740 cm－1处的游离H—C=O振动峰基本消失，而—C=N—振动峰的强度和2850 cm－1、2930 cm－1处的 C—H 振动峰同时增强，前者是漆酶上的—NH2与戊二醛中—CHO作用的结果，后者是由于漆酶中含有C—H键，由此说明漆酶已经在载体表面成功固载.

图3 Fe3O4纳米粒子的磁滞回线

图3是Fe3O4纳米粒子室温时测得的磁滞回线，曲线的剩磁和矫顽力均趋于零，说明具有超顺磁性［23］，这有利于固定化漆酶在液相体系中的分散.对 M －1/H 作图，并外推至1/H=0［27］，得到载体的饱和磁化强度(Ms).外推结果显示Fe3O4纳米粒子的Ms分别为58.3 emu/g，表明，Fe3O4纳米粒子具有很好的磁响应性能，有利于固载漆酶后的分离.

图4为固定化漆酶、Fe3O4/SiO2载体、游离漆酶的紫外－可见吸收光谱图，从图可见，游离漆酶的最大吸收峰在275～280 nm之间，因为蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键在275～280 nm处有吸收高峰，载体固定漆酶之后，在275 nm处出现明显的吸收峰，进一步证明漆酶已经键合到Fe3O4/SiO2的载体上.

图4 样品的紫外可见吸收光谱

2.2 漆酶固定化条件的研究

2.2.1 给酶量对漆酶固载量的影响

由图5可见，漆酶的固载量随着给酶量的增加而增加，当漆酶浓度达到0.6 mg/mL时，固载量达到最大值83.4 mg/g，浓度继续增大，固载量不变.可见，100 mg磁性载体的最大固载量为8.34 mg .

图5 给酶量对漆酶固载量的影响

2.2.2 固定化时间对漆酶固载量的影响

考察不同反应时间对漆酶固载量的影响，保证漆酶和磁性载体充分键合，如图6，当固载时间为12 h时漆酶的固载量最大，继续延长时间，固载量不再增加，确定漆酶与载体的最佳反应时间是12 h.

图6 固定化时间对漆酶固载量的影响

2.3 固定化漆酶酶学性质的考察

2.3.1 最适pH的考察

在20℃考察了固定化漆酶和游离漆酶的最适pH，结果如图7所示.固定化漆酶和游离漆酶都是在pH=5时的酶活相对较高，因此最适pH都为5，即漆酶在固定化之后其最适pH没有改变，而且当pH在3.0～4.0之间时，固定化漆酶的酶活高于游离漆酶，说明固定化漆酶对pH的稳定性较游离漆酶好.

2.3.2 固定化漆酶反应的最适温度

在不同温度下分别对游离酶和固定化酶活力进行测定.如图8，10～30℃之间，固定化漆酶和游离漆酶的反应活性很高，随着温度的继续增加，酶活逐渐下降，相对游离漆酶，固定化漆酶的酶活下降较慢.温度达到70℃时，固定化酶的活性保持在42%，游离酶的活性只剩27%，这表明固定化漆酶具有较好的温度适应性.

图7 pH对游离漆酶及固定化漆酶酶活的影响

图8 温度对游离漆酶和固定化漆酶酶活的影响

2.3.3 固定化漆酶操作稳定性的考察

图9是以ABTS为底物，考察的固定化漆酶重复使用10次的反应结果.数据显示，固定化漆酶在重复使用10次后，酶活仍能保持在初始酶活的85%以上，即固定化漆酶的活力相对稳定，说明漆酶与载体Fe3O4/SiO2键合稳定，具有很好的操作稳定性.

图9 固定化漆酶的操作稳定性

3 结论

通过改进Fe3O4/SiO2载体表面的氨基修饰条件，进行漆酶的固定化，考察漆酶的固定化条件和相应的酶学性质.FTIR数据表明，在室温、乙醇/水为溶剂的较温和条件下，氨基成功修饰了Fe3O4/SiO2载体表面，进而完成了漆酶在该载体表面的固定化.酶学性质测试和磁性测试结果表明，漆酶在Fe3O4/SiO2载体表面固定化之后，最适pH和温度变化不大，但操作稳定性和分离性能得到了明显改善.固定化漆酶在外加磁场的作用下可以与反应体系快速分离.以ABTS为底物，考察固定化漆酶的重复使用性能，发现漆酶在连续使用10次后，酶活仍能保持在初始酶活的85%以上，说明固定化漆酶有很好的操作稳定性，利于漆酶的重复使用.

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Research on Immobilization of Laccase on Fe3O4/SiO2Support and its Properties

Xu Lulu，Wei Dongxue，Wang Hongxia
(Harbin Normal University)

The immobilization of laccase from Trametes Versicolor on magnetic Fe3O4/SiO2support by crosslinking method under mild conditions is investigated.TEM，FTIR，UV－vis and VSM measurements are used to characterize the immobilized laccase.The results show that the immobilization of laccase has little effect on optimum pH and temperture，while thermal stability，operation stability and separation are improved greatly.Using ABTS as substrate，the immobilized laccase is tested and separated under an external magnetic field，after 10 cycles of repeated use，the activities of enzyme still maintaine above 85%of the intial activity.

Laccase;Immobilization;Fe3O4/SiO2

2011－05－14

(责任编辑:李佳云)