鸡冠透明质酸工业化生产条件优选

汪 建，谢 镇，汪 清

(1.贵阳中医学院生化教研室，2.贵州省冶金化工研究所，3.贵州省理化测试分析研究中心，贵州 贵阳550002)

鸡冠透明质酸工业化生产条件优选

汪 建1，谢 镇2，汪 清3

(1.贵阳中医学院生化教研室，2.贵州省冶金化工研究所，3.贵州省理化测试分析研究中心，贵州 贵阳550002)

目的 从鸡冠中提取透明质酸。方法 绞肉机破碎鸡冠。比较打浆与不打浆进行酶解后提取的效果，优化提取条件。结果 打浆虽可缩短提取时间，但得率下降，相对分子质量降低。以绞肉机粉碎两次。升高温度至60℃、120目布袋过滤，能较好的除去杂质。提取液使用2倍乙醇沉淀较优。成品透明质酸溶解于水再次酶解，除蛋白质杂质。结论 获得了较优的生产条件，成功从鸡冠中提取出透明质酸。

鸡冠;透明质酸;工业化生产;优选条件

以鸡冠为原料工业化生产透明质酸(hyaluronic acid，HA)，酶解浸提是HA生产中的关键阶段，对此已有研究报道［1］。酶解后对提取液分离、纯化，其生产中的影响因素已有分析［2］，本研究在以前报道的基础上做了更深入的探索。

1 仪器与试药

TJ22-A型绞肉机(广东恒联食品机械有限公司);ML65-F分体立式胶体磨(上海博生水泵制造有限公司);φ70 cm不锈钢抽滤罐。

鸡冠(产地:山东);粗胰酶(胰蛋白酶比活力≥600 u/g、胰淀粉酶比活力≥7 000 u/g、胰脂肪酶比活力≥4 000 u/g，产地:湖南);硅藻土(60～180目，工业级);氢氧化钠和盐酸均为工业级。

2 方法与结果

2.1 HA生产工艺路线

［3］。

2.2 生产条件选择

2.2.1 鸡冠粉碎 鸡冠投料100～150 kg，经绞肉机粉碎后，一半再次粉碎后酶解浸提(不打浆)，另一半用胶体磨打浆后酶解浸提(打浆)，对两组在酶解提取时间和效果的影响上作了比较研究，结果见图1。

由图1可见，两组提取液在酶促反应前期，鸡冠中HA逐渐溶解和释放，溶液黏度不断升高。水解一段时间后，鸡冠中HA大部分溶解入水中，曲线上升到顶点并出现短暂平台，之后HA自身降解成为主要矛盾，提取液黏度转为下降，提示酶解已进行完毕。两组成品HA检测数据见表1。

图1 打浆与不打浆对HA提取时间和黏度变化的影响Fig.1 Effect on HA in time of its extraction and change of its viscosity whether cockscomb is made into pulp of meat or particles of meat

表1 打浆组与不打浆组各种参数变化的比较Tab.1 Comparison between the changes of various parameters of groups whether cockscomb is broken or not

打浆组提取高峰出现在6～7 h，比不打浆组高峰出现时间缩短3 h。但打浆过程同时破坏了HA，使成品中大分子HA减少，小分子HA增多，并不易被两倍乙醇沉淀下来，导致收率下降、黏度下降。鉴于打浆对HA的破坏，在HA的提取中，选择用绞肉机进行两次粉碎，然后再提取的方法更优。

2.2.2 酶解提取HA中监控指标的确定 在提取HA的工艺中，寻找简便易操作的质量监控指标，是保证HA生产质量及收率的重要前提。经反复对比研究，发现HA在提取液中的溶解量及相对分子质量(Mr)，与提取液黏度大小呈正相关变化。在生产实践中，采用测定提取液黏度作为提取效果及终止反应的指标［1］，对保证HA质量十分有效;经一段时间实际操作后，又简化为直接读取“乌氏黏度计”中提取液流速时间作为变量指标，省去了换算成黏度的麻烦，使生产中的质量监控变得非常快速、简单而易操作。

2.2.3 提取过程中搅拌强度的选择 在HA提取过程中需要不断加热以保持45℃恒温，如果不搅拌，会带来控温困难、局部过热而影响HA的提取。但是，搅拌又产生强大剪切力，破坏HA的Mr。经研究，找到了较好的搅拌条件，见表2。搅拌强度过大，对HA造成破坏，提取液黏度下降明显，不宜用于生产。选择双叶平桨、搅拌速度60 r/min，提取效率高，生产时间短，对黏度影响小，适用于生产。

2.2.4 酶解液过滤条件 酶解液内含有鸡毛、未溶解的鸡冠和杂质，由于提取液黏度极大，给过滤带来困难;使用孔径大的滤布过滤，在真空抽滤下仍无法进行。分析发现，高黏度的滤液象粥样斑块一样，敷在滤布上堵塞滤孔;加硅藻土助滤，仍发生粥样斑块敷在硅藻土上，无法过滤。经反复试验，确立了提高滤液温度的方法解决这一难题，而且可以用120目的滤布加硅藻土助滤快速过滤。见表3。

表2 不同搅拌条件对提取液黏度的影响Tab.2 Effect on viscosity of extraction under different conditions of agitation

在生产实践中，分离杂质的时间不能拖得太长，否则会带来HA降解、黏度下降、甚至细菌生长产生腐败的情况。55℃时，鸡冠投料150 kg可得提取液400 kg，用直径70 cm的真空抽滤罐全部过滤完需要20 h以上，并且1 h需要更换滤布1次，提取液损失很大、还容易因滤液温度降低而孳生细菌导致腐败。65℃过滤虽快，对HA降解的影响也大，不宜使用。所以，在生产中选择60℃作为过滤温度比较恰当，由于过滤较快，对HA降解的影响不大;滤液在过滤时温度自然下降，但仍保持在抑菌的45℃范围［1］;温度降低，黏度回升到7.7左右。助滤介质硅藻土，180目以上时易堵塞，60～180目较为理想;滤布的选择，目数小的过滤效果不好，目数大的过滤速度太慢，失去生产意义，而120目比较适中。

表3 120目滤布抽滤下不同温度对过滤的影响Tab.3 Effect on filtration at different temperatures via a clothing filter of 120 mu

2.2.5 不同乙醇用量沉淀HA对蛋白质含量的影响 HA提取液经反复除杂质及过滤，得到澄明溶液，再用95%乙醇沉淀得HA成品。选用不同比例的乙醇进行沉淀，对HA产品中的蛋白质含量有显著影响。本研究选用2个不同批次的提取液，每批次再分为A、B两组，分别用2.0倍和3.5倍95%乙醇进行沉淀，分析不同乙醇用量对HA质量的影响，结果见表4。从表4可见，2倍乙醇沉淀对HA收率虽低于3.5倍乙醇沉淀物，其蛋白质的含量也明显降低，而产品Mr却显著升高，葡糖醛酸含量也较高。分析原因，鸡冠中的蛋白质经酶水解，生成了大小不等的肽链和氨基酸，在2倍乙醇沉淀时，大分子肽链与HA一道沉淀了，短肽、寡肽及降解的小分子HA却留在了上清液中。如果用3.5倍乙醇沉淀时(低于3.5倍沉淀不完全，大于3.5倍沉淀不增加)，所有的HA和大小肽链一起沉淀下来，使产品HA的收率升高，但蛋白质等杂质含量也明显升高，从葡糖醛酸含量明显降低来看，HA的纯度受到了影响。因此，在以后的生产中，均采用2倍乙醇沉淀法生产HA，取得了满意效果。

表4 不同乙醇浓度沉淀对HA中蛋白质含量的影响Tab.4 Effect on protein contents when ethanol of different densities is precipitated

2.2.6 二次酶解对HA纯度及Mr的影响 本工艺对HA质量的控制是比较稳定的，特别是蛋白质含量可控制在5%～15%。对连续生产的60批产品作了一个分类，其中蛋白质含量＜5%的占27%，5% ～10%的占25%，10% ～15%的占48%。仅有一批次产品的蛋白质含量过高，达到了24%(企业定为不合格品)。在生物制品的生产中，难免出现次品，对次品的再处理也是必须研究的课题。为此，本研究选取了4组有代表性的产品(蛋白质含量分别代表:24%，10% ～15%，5% ～10%，＜5%)，进行了再次酶解除蛋白，工艺流程见图2。二次酶解纯化结果如表5。可见，二次酶解除蛋白的效果明显，4批次蛋白质均降至4%以下，但HA的Mr也下降;糖醛酸的含量明显提高，说明HA得到了纯化。

图2 二次酶解除蛋白的简单流程图Fig.2 Simple chart of procedure of second enzymes in relieving protein

表5 不同蛋白质含量的HA二次酶解结果Tab.5 Results when HA is secondly enzymed in different contents of Protein

3 讨论

工业化生产HA的工序中，各种条件的控制都应以尽量减少HA的降解为前提，同时还要兼顾除蛋白质的效果。在生产实践中体会到，鸡冠过度粉碎(打浆)、酶解时间过长或二次酶解，虽然可以明显降低蛋白质含量，但HA的降解也增大。

在布袋过滤前，提取液温度从45℃升至60℃，应快速完成(本生产用时大约10 min)，达温后立即过滤，以尽量减少高温持续时间，减低对HA降解的影响。

小分子HA在2倍乙醇浓度下不易被沉淀，加大乙醇用量可提高HA的收率，但产品中蛋白质含量也增高，还增加了乙醇回收的工作量，增大生产成本，不宜使用。

使用超滤器虽然能起到纯化HA的作用，但大规模生产中不能承担处理量而不实用，因为在生产中增加工作环节，就会增加生产时间、增加污染、增加腐败，尤其是从气温较高的晚春到晚秋，一年中的大部分生产时间，稍不注意就会导致提取液腐败，出现次品。

当产品蛋白质含量＞15%时，二次酶解效果较优，而非酶解的其他方法纯化效果不好。如果蛋白质含量＜15%，不宜使用强烈的酶解方法，用十二烷基硫酸钠(SDS)来纯化，可使蛋白质含量降至0.5%以下，获得较高纯度的HA。

参考文献:

［1］汪 建，汪 清，谢 镇.酶解条件控制对透明质酸工业化提取的影响［J］.中国医药工业杂志，2010，41(1):20-23.

［2］谢 镇，汪 建，汪 清.鸡冠透明质酸工业化生产中质量影响因素分析［J］.中国生化药物杂志，1993，(4):19-22.

［3］汪 建，谢 镇，汪 清.鸡冠透明质酸的工业化生产［J］.中国生化药物杂志，1993，(4):16-18.

The optimization of the industrial production conditions of cockscomb hyaluranic acid

WANG Jian1，XIE Zhen2，WANG Qing3
(1.Teaching Department of Biochemistry，Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，2.Guizhou Institute of Metallurgical and Chemical Engineering，3.Guizhou Research Center of Physical Test and Chemical Analysis，Guiyang 550002，China)

Purpose To extract hyaluranic acid from cockscomb.Methods and Results It's better to use a mincer to mash cockscomb.The impurities can be effectively removed from the post-enzyme extract via a clothing filter of 120 mu when the temperature is raised to 60℃，and the sedimentation is better via of two times of the ethanol.Hyaluranic acid then gets a second enzyming in water to decrease protein impurities remarkably.Conclusion Extract hyaluranic acid from cockscomb successfully by this method under a better condition of production.

cockscomb;hyaluranic acid;industrial production;optimization

TQ464.5

A

1005-1678(2011)06-0472-04

2010-08-25

汪 建，男，副教授，从事生化药物提取及中试生产放大研究，Tel:0851-5616294，E-mail:jshuims@qq.com。