天津地区志贺菌耐药性及整合子携带调查

王 俊 祁 伟 吴 瑾 王淑香 郭文学 马艳红

天津地区志贺菌耐药性及整合子携带调查

王 俊 祁 伟△吴 瑾 王淑香 郭文学 马艳红

目的：了解天津地区志贺菌抗生素耐药性变迁及1、2类整合子携带状况。方法：K-B纸片法测定1981—1983年及2009年天津地区临床分离的57株志贺菌药敏情况。以煮沸法制备细菌总DNA作为PCR扩增模板。PCR方法扩增1、2类整合子整合酶及可变区并测序分析。PCR产物直接测序，结果经BLAST程序与GenBank数据库标准菌株比对分析。结果：1981—1983年组志贺菌对四环素、链霉素、氯霉素及复方新诺明敏感率低，3种及3种以上抗生素多重耐药率为66.67%；2009年组志贺菌对氨苄西林、链霉素、复方新诺明、哌拉西林和四环素敏感率低，3种及3种以上抗生素多重耐药率为83.33%。1981—1983年组1类整合子阳性率为87.88%（29/33），27株可变区含氨基糖苷类药物耐药基因aadA；1株宋内志贺菌可变区含甲氧苄啶耐药基因dfrA17和氨基糖苷类药物耐药基因aadA5；未发现2类整合子阳性株；2009年组1类整合酶阳性率为79.17%（19/24），可变区及末端扩增均阴性；2类整合子阳性率87.50%（21/24），可变区含dfrA1+sat1+aadA1，介导甲氧苄啶、链丝菌素和链霉素耐药;其中17株1、2类整合酶均阳性。结论：2009年分离的志贺菌抗生素耐药较上世纪80年代分离的志贺菌增强，多重耐药菌株增加。天津地区志贺菌携带1、2类整合子。

志贺菌属 整合子类 药物耐受性 纸片扩散抗菌试验 聚合酶链反应 天津

志贺菌属是导致人类细菌性腹泻的常见致病菌之一。20世纪80年代以来，随着广谱抗生素的广泛使用，耐药志贺菌逐渐增多。文献报道，1、2类整合子与志贺菌耐药相关[1]。本文研究了志贺菌对15种抗生素的耐药性及1、2类整合子的携带情况，旨在了解本地区志贺菌耐药性变迁和1、2类整合子携带情况。

1 资料与方法

1.1 菌株来源 实验菌株为分离自天津市多家三级甲等医院肠道门诊患者（2~76岁）粪便标本的志贺菌株共57株，其中1981—1983年分离33株，由本研究所保存；2009年6月—10月分离24株。所有菌株均经常规鉴定证实。

1.2 试剂 药敏纸片为复方新诺明、诺氟沙星、左氧氟沙星、氨苄西林、哌拉西林、头孢唑啉、头孢曲松、头孢噻肟、头孢他啶、亚胺培南、四环素、氯霉素、链霉素、庆大霉素、阿米卡星，共15种，购自北京天坛生物制品研究所。引物合成由上海生工生物技术有限公司完成，PCR产物测序由北京六合华大基因技术有限公司完成。

1.3 方法

1.3.1 药物敏感试验 抗生素敏感性试验依据CLSI2009年推荐标准，采用K-B纸片法进行检测。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。

1.3.2 细菌总DNA的提取 以煮沸法[2]制备细菌总DNA作为PCR扩增模板。

1.3.3 整合子的检测与分析 引物intI1L/intI1R[2]、qacE△1F/sul1B[3]、intI2L/intI2R[2]分别扩增1类整合子整合酶保守末端及2类整合子整合酶，引物hep58/hep59[4]、hep74/hep51[5]分别扩增1、2类整合子可变区，见表1。根据GenBank数据库公布序列自行设计下游引物dfrA12R、dfrA17R、aadAR、aadA5R，以hep58为上游引物扩增相应耐药基因盒；取PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统下观察结果。PCR产物直接测序，结果经BLAST程序与GenBank数据库标准菌株比对分析。

表1PCR扩增反应引物

1.3.4 限制性内切酶反应 取PCR扩增产物10 μL加内切酶缓冲液1.5 μL，酶Hinf I1 μL，37 ℃孵育2 h；将酶切产物8 μL加上样缓冲液1 μL，2%的琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统下观察结果。

1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件，Fisher确切概率法进行统计学分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 药敏实验结果 1981—1983年组志贺菌对四环素敏感率最低，其次是链霉素、氯霉素、复方新诺明，对3种及3种以上抗生素耐药多重耐药菌株占全部菌株的66.67%（22/33），对氨苄西林等敏感率均大于80%；而2009年组志贺菌对氨苄西林敏感率最低，其次是链霉素、复方新诺明、哌拉西林和四环素，3种及3种以上抗生素多重耐药菌株为83.33%（20/24）。对氨苄西林、哌拉西林、头孢噻肟、头孢唑啉、头孢曲松、复方新诺明敏感率2009年组较1981—1983年组下降，而四环素及氯霉素敏感率则升高。志贺菌对三代头孢菌素及氟喹诺酮类药物敏感率高，未发现亚胺培南耐药株，见表2。

2.2 1类整合子检测结果 1981—1983年组1类整合子阳性率为87.88%（29/33），其中福氏志贺菌87.5%（28/32），29株1类整合酶阳性株末端扩增均阳性。28株整合子可变区阳性，其中27株扩增产物大小相同，酶切分析证实为同一片段，大小约为1 000 bp，测序显示含氨基糖苷类药物耐药基因盒aadA；另1株宋内志贺菌可变区大小约1 700 bp，含甲氧苄啶耐药基因dfrA17和氨基糖苷类药物耐药基因aadA5，见图1。2009年组阳性率为79.17%（19/24），其中福氏志贺菌12株，宋内志贺菌6株，鲍氏志贺1株。19株1类整合酶阳性，但1类整合子可变区及末端扩增均阴性，见表3。2009年组志贺菌基因盒扩增显示6株blaoxa-30和aadA1阳性,7株dfrA12扩增阳性，经与GenBank数据库进行同源性分析（BLAST）结果为99%；dfrA17及aadA5扩增阴性。

2.3 2类整合子检测结果 1981—1983年组33株中均阴性。2009年组24株志贺菌中21株（87.50%）2类整合酶扩增阳性，其中福氏志贺菌11株，宋内志贺菌为9株,鲍氏志贺菌为1株；其中1、2类整合酶均阳性17株。21株2类整合子可变区阳性产物经限制性内切酶Hinf I酶切分析，带型一致，为同一片段，见图2。选取1例2类整合子扩增阳性的标本测序，发现2类整合子大小约为2 200 bp，与GenBank数据库进行BLAST比对，含有甲氧苄啶耐药基因dfrA1、链丝菌素耐药基因sat1和链霉素耐药基因aa⁃dA1，同源性达99%。

表2 57株志贺菌药敏结果

表3 1、2类整合子检测结果

3 讨论

在我国，由志贺菌引起的细菌性痢疾的发病率仍较高，其中以福氏志贺菌为主，但宋内志贺菌所占比例有上升趋势。天津地区细菌性痢疾现今流行的菌型以福氏志贺菌和宋内志贺菌为主，与上海地区报道相似[6]。

本研究药敏结果显示，志贺菌对氨苄西林、哌拉西林、头孢唑啉、头孢噻肟、头孢曲松、复方新诺明耐药率明显上升，而四环素及氯霉素耐药率较前明显下降，且有统计学意义，考虑与临床应用频度及抗生素的选择有关。2009年组志贺菌对氯霉素耐药率与上海地区的调查结果相似[6]，但与江苏淮安的调查结果[7]（80%左右）相比有很大不同，可见志贺菌对氯霉素的耐药率表现出明显的时间性差异及地域性差异。本实验结果还显示天津地区2009年组志贺菌对3种及3种以上抗生素耐药的多重耐药菌株较1981—1983年组明显增加。

整合子是1989年由Stokes等[8]首次提出的，整合子的基本结构由保守末端（5conserved segment，CS）、保守末端（conserved segment，CS）和两者之间的可变区（variable region）组成。CS是整合子的基本结构，包括编码整合酶（integrase，IntI）的基因（intI）、整合子重组位点attI和整合子可变区启动子（Pant）。可变区带有不同数量和功能的基因盒，但可变区并不是整合子的基本结构，有的整合子在CS和CS之间没有基因盒插入。整合子在整合酶的作用下能识别并俘获或删除移动性基因盒，并在位于整合子上游的启动子的作用下得到表达，使细菌具有耐药及多重耐药性。

本研究显示天津地区志贺菌1类整合酶阳性率1981—1983年组为87.88%，其中福氏志贺菌87.5%，2009年组为79.17%，其中福氏志贺菌为92.31%（12/13）。扩增1类整合子可变区发现，1981—1983年组28株可变区阳性，其CS也均为阳性，但是2009年组19株1类整合酶阳性，可变区及CS均为阴性，为除外CS变异造成漏检,本研究中根据1类整合子中通常携带的耐药基因盒dfrA12、dfrA17、aadA及aadA5基因序列，自行设计下游引物dfrA12R、dfrA17R、aadAR、aadA5R，以hep58为上游引物，扩增相应耐药基因盒，以便进一步确认是否存在可变区，结果显示7株dfrA12扩增阳性；6株aadA扩增阳性，并在其上游包含blaoxa-30基因，表明在这些菌株中，1类整合子CS缺失或存在变异。2类整合酶扩增结果显示1981—1983年组33株志贺菌均为阴性，2009年组阳性率为87.5%。Mammina等[9]研究发现意大利南部宋内志贺菌中2类整合子阳性至少要追溯到上世纪80年代。本研究2类整合酶阳性菌株可变区扩增均阳性，经酶切分析证实为同一片段，序列比对显示2类整合子携带甲氧苄啶耐药基因dfrA1、链丝菌素耐药基因sat1和链霉素耐药基因aadA1。

随着广谱抗生素的广泛使用，志贺菌属耐药率较前提高，多重耐药株较前增多。1、2类整合子广泛存在于志贺菌属内，部分菌株可能存在有1类整合子CS缺失或变异。

[1]Gassama Sow A,Aïdara-Kane A,Barraud O,et al.High prevalence of trimethoprim-resistance cassettes in class 1 and 2 integrans in Sen⁃egalese Shigella spp isolates.[J].J Infect Dev Ctries,2010,4(4):207-212

[2]Ploy MC,Denis F,Courvalin P,et al.Molecular characterization of in⁃tegrons in Acinetobacter baumannii:Description of a hybrid class 2 integron[J].Antimicrob Agents Chemother,2000,44(10):2684-2688.

[3]Dalsgaard A,Forslund A,Serichantalergs O,et al.Distribution and content of class 1 integrons in diferent Vibrio cholerae O-serotype strains isolated in Thailand[J].Antimicrob Agents Chemother,2000,44(5):1315-1321.

[4]White PA,McIver CJ,Deng Y,et al.Characterisation of two new gene cassettes,aadA5anddfrA17[J].FEMS Microbiol Lett，2000,182(2):265-269.

[5]White PA,McIver CJ,Rawlinson WD.Integrons and gene cassettes in the Enterobacteriaceae[J].Antimicrob Agents Chemother，2001,45(9):2658-2661.

[6]施苗盛,陈文雨,沈嘉玲.志贺菌的菌型分布与耐药性分析[J].临床和实验医学杂志,2008,7(9):94-95.

[7]施城东.178株福氏志贺菌的药敏试验结果及临床应用分析[J].检验医学与临床,2009,6(7):532

[8]Stokes HW,Hall RM.A novel family of potentially mobile DNA ele⁃ments encoding site-specific gene-integration functions：integrons[J]．Mol Microbiol，1989，3(12):1669-1683

[9]Mammina C,Aleo A,Romani C，et al.Shigella sonnei biotype G car⁃rying class 2 integrons in southern Italy:a retrospective typing study by pulsed field gel electrophoresis[J].BMC Infect Dis,2006,6:117.

Survey of Antimicrobial Susceptibility and Integron Carriage of Shigella Isolates in Tianjin

WANG Jun,QI Wei,WU Jin,WANG Shuxiang,GUO Wenxue，MA Yanhong

Institute of Infection Disease,Second Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300211,China

Objective:To investigate changes in antibiotic resistance and carriage of class 1 and class 2 integrons of shi⁃gella isolates in Tianjin,China.Methods:A total of 57 clinical isolates of shigella identified in Tianjin during the years of 1981—1983 and 2009 were studied.Antibiotic susceptibility was detected by K-B disk diffusion method.Carriage of class 1 and class 2 integrons was investigated by polymerase chain reaction(PCR)with specific primers and confirmed by restriction endonuclease analysis of amplicons.Results were compared by BLAST program and GenBank database.Results:In the Shi⁃gella strains collected during the years of 1981—1983,the sensitive rates to tetracycline,streptomycin,chloromycetin and tri⁃methoprim-sulfamethoxazol were lower,and the multidrug resistant rate was 66.67%.In the other strains collected during the years 2009，the sensitive rates to ampicillin,streptomycin,trimethoprim-sulfamethoxazol,pailaxilin and tetracycline were lower,and the multidrug resistant rate was 83.33%.In the group during the years of 1981—1983,class 1 integrons were found in 87.88%(29/33)of Shigella isolates.Twenty-seven of these integron 1-positive isolates contained gene cassetteaa⁃dA,which confer resistance.Only the Shigella sonnei isolates contained gene cassettedfrA17+aadA5which confer trime⁃thoprim and streptomycin-resistance.None integron 2-positive isolates were found.In the other group during the years 2009,class 1 integrase were found in 79.17%(19/24)of Shigella isolates,however,variable region andconserved segment of class 1 integron were negative in all isolates.Class 2 integrons were present in 87.50%（21/24）of the Shigella isolates.All of these integron 2-positive isolates contained constant gene cassette arrays of dfrA1+sat1+aadA1,which confer trimethoprim,streptothricin and streptomycin-resistance to.Both class 1 and class 2 integrase were positive in 17 Shigella isolates.Conclu⁃sion:Antibiotic resistance has been developed in the evolution of Shigella strains.Integron carriage was very common in the shigella isolates.

shigella integrons drug tolerance disk diffusion antimicrobial tests polymerase chain reaction TIANJIN

10.3969/j.issn.0253-9896.2011.05.011

300211 天津医科大学第二医院，天津市感染性疾病研究所

△通讯作者 E-mail：qiweiwyx@yahoo.com

（2010-06-01收稿 2010-08-10修回）

（本文编辑 魏杰）