吲哚乙酸、萘乙酸对蚕豆根尖细胞微核的诱导作用

陈凯峰，邓 妍，郭建军，刘中来，祁 超

（华中师范大学 生命科学学院，武汉 430079）

植物激素是植物细胞接受特定环境信号诱导产生的、可调节植物生理反应的活性物质.它们在植物的生长过程中调控植物的生长、发育与分化等过程［1］.所以，农业上使用人工合成的激素作用于农作物，以达到农产品增产的目的.但随着剂量逐渐加大，农作物污染问题也突显出来.

农药、重金属及各类有害物质的检测并不少见，但人工植物激素对植物的损害的研究并不多.微核试验是用来评价药物、放射线、有毒物质等对人体细胞或体外培养细胞遗传学损伤的一个直观有效可行的方法，在遗传毒理、医学、食品、药物、环境等诸多方面有着广泛的应用［2］.本文选用2种常见植物激素吲哚乙酸、萘乙酸，应用微核实验研究了它们对蚕豆所造的遗传伤害.

1 材料与方法

1.1 材料

蚕豆（Vicia faba），松滋青皮蚕豆，来源于华中师范大学生命科学院.

1.2 试剂

卡诺氏固定液 ，1mol／L HCl，吲哚乙酸，萘乙酸，环磷酰胺（AR，均购于亦新生物公司）.

1.3 方法［3］

1.3.1 样品的制备与固定 选择饱满、大小均匀的蚕豆种子用清水冲洗干净，浸泡24h，放置磁盘中用湿纱布覆盖，25℃恒温培养，12h换水1次.待根长至1.5～3cm 后，用浓度分别为1、3、5、7、10、20、40、60、80、100mg／L 的吲哚乙酸和萘乙酸处理6h、12h、24h.阳性对照为环磷酰胺，阴性对照为蒸馏水.处理后，用蒸馏水冲洗3次，每次3min，然后25℃恒温条件使根尖细胞恢复培养24h.剪下1cm长的根尖用卡诺氏固定液固定12 h.若固定后的根尖需存储，需将其转至70%乙醇中于4℃冰箱内保存.

1.3.2 染色与制片 固定后，不同浓度处理的根尖随机取5个，用蒸馏水清洗3次，1次5min.放入EP管，加入1mol／L盐酸，60℃恒温水解10min.用蒸馏水清洗3次，1次5min.用解剖针在载玻片上将根尖捣碎后，改良苯酚品红染色10 min，加盖玻片，轻敲打压片.

1.3.3 观察与计数 在40倍光学显微镜下，从左向右，随机选取清晰的视野.

微核识别：在间期细胞中，凡在主核大小1／3以下，形态呈圆形、椭圆形、或不规则形，与主核分离的小核，并且其着色与主核相似.

每个根尖观察至少1 000个细胞.记录有丝分裂数﹑微核细胞数和染色体畸变数.按如下公式计算：

有丝分裂数指数（MI%）＝分裂细胞数／观察细胞总数×100%；

微核千分率（MCN‰）＝微核细胞数／观察细胞总数×1000‰；

染色体畸率（CAF%）＝染色体数／观察细胞总数×100%.

1.3.4 数据统计分析软件 对所得数据用Origin6.1进行方差分析，采用t检验检测不同处理组与对照组间的差异显著性.

2 结果与分析

2.1 吲哚乙酸、萘乙酸对蚕豆根尖细胞有丝分裂﹑微核率﹑染色体剂量关系

由表1，表2可以看出，随着吲哚乙酸浓度的加大，微核率的增加呈双波型，在5mg／L、40mg／L时到达峰值，所有数值均大于阴性对照组，有5个浓度处呈显著差异（P＜0.05）.有丝分裂指数在吲哚乙酸浓度≤7mg／L，随着浓度的增加，逐渐上升，当浓度达10mg／L后开始递减，低于阴性对照，有6个浓度处呈显著差异（P＜0.05）或极显著差异（P＜0.01）.当浓度增加到40mg／L时，又开始回升；有丝分裂指数在浓度≤7mg／L时与微核率增加呈正相关；在浓度≥10mg／L，与微核率增加呈负相关.染色体畸变在吲哚乙酸浓度≤5mg／L时，随着浓度增加而逐渐上升，当浓度到达10mg／L之后骤然下降，有8个浓度处呈显著差异（P＜0.05）或极显著差异（P＜0.01）.以上数据说明，当吲哚乙酸浓度≤7mg／L时，有丝分裂﹑微核率﹑染色体呈正相关增长，有一定的剂量－效应关系.当浓度≥10mg／L时，随着浓度增加，有丝分裂指数和染色体畸变降到低于对照组，而后有丝分裂指数在40～100mg／L回升，微核率却下降，与有丝分裂指数呈负相关.各类染色体畸变见图1.

随着萘乙酸浓度的加大，微核率的增加呈双波型，在3mg／L、40mg／L时到达峰值，所有数值均大于阴性对照组，有3个浓度处呈显著差异（P＜0.05）.有丝分裂指数在萘乙酸浓度≤3mg／L，随着浓度的增加而增加.在浓度＞3mg／L时，开始递减，在浓度≥60mg／L时，又开始回升.于阴性对照相比，有6个浓度处呈显著差异（P＜0.05）或极显著差异（P＜0.01）.染色体畸变随着萘乙酸浓度的增加，呈波浪型，但总体趋势是先增后降，有4个浓度处呈显著差异（P＜0.05）或极显著差异（P＜0.01）.以上数据说明，当萘乙酸浓度≤3mg／L时，有丝分裂﹑微核率﹑染色体呈正相关增长，有一定的剂量－效应关系.随着浓度的增加，有丝分裂指数和染色体畸变降到低于对照组，而后有丝分裂指数在40～100mg／L回升，微核率下降，与有丝分裂指数呈负相关.各类染色体畸变见图1.

由两者植物激素对蚕豆根尖各项指标影响的比较，可以看出相似的趋势：随着浓度的增加，各项指标成波动型变化.在浓度较低时，它们能促进细胞分裂，微核率和染色体畸变率与细胞分裂指数呈正相关，并存在一定剂量－效应关系.浓度较高时它们能抑制细胞分裂，微核率和染色体畸变率与之呈负向关系，剂量－效应关系不明显.

2.2 吲哚乙酸、萘乙酸对蚕豆根尖细胞有丝分裂﹑微核率﹑染色体的时间关系

图2～图7是用不同浓度的吲哚乙酸、萘乙酸处理蚕豆6h、12h、24h的柱状图.可以看出，随着作用时间的延长，两种植物激素对蚕豆根尖细胞有丝分裂﹑微核率﹑染色体的影响趋势越来越突出.在12h和24h时，不同浓度所造成的显著差异或极显著差异均高于6h时，并表现出一定的遗传损伤.由此也验证了上面所分析的结果.

表1 不同浓度吲哚乙酸对蚕豆根尖有丝分裂﹑微核率﹑染色体的影响（处理时间6h）Tab.1 Effects of the different concentrations of IAA on MI，FMN and CAF in the root rip cells of Vicia faba for 6h

表2 不同浓度萘乙酸对蚕豆根尖有丝分裂﹑微核率﹑染色体的影响（处理时间6h）Tab.2 Effects of the different concentrations of NAA on MI，FMN and CAF in the root rip cells of Vicia faba（6h）

图1 吲哚乙酸、萘乙酸诱发的蚕豆根尖细胞染色体畸变Fig.1 Chromosomal aberrations induced by IAA and NAA in the root rip cells of Vicia faba

图2 吲哚乙酸对蚕豆根尖细胞有丝分裂的影响（6h，12h，24h）Fig.2 Effects of the different concentrations and times of IAA on mitosis index in the root rip cells of Vicia faba for 6h，12hand 24h（＊P＜0.05，＊＊P＜0.01）

图3 吲哚乙酸对蚕豆根尖细胞微核率的影响（6h，12h，24h）Fig.3 Effects of the different concentrations of IAA on micronucleus rate in the root rip cells of Vicia faba for 6h，12hand 24h（＊P＜0.05，＊＊P＜0.01）

图4 吲哚乙酸对蚕豆根尖细胞染色体的影响（6h，12h，24h）Fig.4 Effects of the different concentrations and times of IAA on chromosomal aberration Vicia faba root rip cells for 6h，12hand 24h（＊P＜0.05，＊＊P＜0.01）

图5 萘乙酸对蚕豆根尖细胞有丝分裂的影响（6h，12h，24h）Fig.5 Effects of different concentrations of AA on micronucleus rate in the root rip cells of Vicia ba for 6h，12hand 24h（＊P＜0.05，＊＊P＜0.01）

图6 吲哚乙酸对蚕豆根尖细胞微核率的影响（6h，12h，24h）Fig.6 Effects of different concentrations of NAA on micronucleus rate in the root rip cells of Vicia faba for 6h，12hand 24h（＊P＜0.05，＊＊P＜0.01）

图7 萘乙酸对蚕豆根尖细胞染色体的影响（6h，12h，24h）Fig.7 Effects of the different concentrations and times of NAA on chromosomal aberration in the root rip cells of ia faba for 6h，12hand 24h（＊P＜0.05，＊＊P＜0.01）

3 讨论

吲哚乙酸和萘乙酸是常见的植物激素，主要作用是促进细胞分裂，加速植物成长.但在浓度稍高时即会引起抑制生长的作用，更高浓度即对植物产生毒害作用.在本文中，2种植物激素表现出相一致的趋势：当浓度较低时，促进了细胞分裂，微核率和染色体畸变率与细胞分裂指数呈正相关.根据微核形成的原理：微核是细胞的染色体发生断裂后，细胞进入下一次分裂时，染色体片段不能随有丝分裂进入子细胞，而在细胞浆中形成的圆形或椭圆形微小核［4］，可以推测能进入下次分裂周期的细胞越多，产生微核率和染色体畸变率就越高.反之，细胞分裂的指数越低，能观察到的微核和染色体畸变就越少.这也能解释在40～100mg／L时，有丝分裂指数已低于对照组，微核率和染色体畸变率也出现下降趋势（仍高于对照组）.但在40～100mg／L时，有丝分裂指数有回升趋势（仍低于对照组），微核率和染色体畸变率还是在下降.可能原因是植物激素在这个浓度区间激发了植物体内某些清理机制，加强了DNA的修复.另外，有丝分裂指数的回升趋势并不明显，可能还达不到增加微核和染色体畸变的作用.

［1］肖爱国.植物激素在农业生产中的应用［J］.青海农牧业，2009（1）：41.

［2］曹 佳.微核试验在中国的应用、发展与展望［J］.遗传，2003，25（1）：73－76

［3］孔志明.环境毒理学（第2版）［M］.南京：南京大学出版社，2004：196－198.

［4］曹 佳，林 真，余争平.微核试验：原理、方法及其在人群监测性评价中的应用［M］.北京：军事医学科学出版社，2000：1－9.