竹红菌素培养基的初步优化

胡明明蔡宇杰廖祥儒胡 艳李枝铃张大兵

（1.江南大学生物工程学院，江苏 无锡 214122；2.江苏汉邦科技有限公司，江苏 淮安 223001）

竹红菌素培养基的初步优化

胡明明1蔡宇杰1廖祥儒1胡 艳1李枝铃2张大兵2

（1.江南大学生物工程学院，江苏 无锡 214122；2.江苏汉邦科技有限公司，江苏 淮安 223001）

利用竹黄菌株通过液态发酵的方法获得活性成分竹红菌素系列化合物。首先采用单因素的分析方法找到了竹黄菌比较合适的液态发酵培养基：蛋白胨作为培养基氮源，葡萄糖作为培养基碳源。然后利用响应面法分析探讨蛋白胨和葡萄糖的最佳浓度。结果表明，蛋白胨最佳浓度为1.82g/L，葡萄糖的最佳浓度为2.42g/L。优化后竹红菌素产量为0.62g/L。

竹红菌素；液态发酵；优化培养基

竹黄（shiraia bambusicola），别名竹花、竹茧、竹赤团子等，是一种传统的名贵中药。竹黄中的有效成分主要是竹红菌素系列化合物。由于竹红菌素具有良好的光敏特性，作为很有潜力的光敏剂受到广泛关注和研究，它具有镇痛、抗炎、抗菌抗肿瘤等作用［1－2］。同时作为新型的光活化农药和光电转换材料，在国内外得到了广泛研究［3］。

直接从野外竹黄中提取竹红菌素国内外文献［4－5］有过报道。但是野外竹黄资源有限。蔡宇杰等［6－7］通过固态发酵的方法来获得竹红菌素，但固态发酵周期长，不易实现工业化。本试验对竹黄菌液态发酵法制备竹红菌素的培养基进行初步优化，旨在为将来大规模发酵生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及培养方法

Shiraia bambusicola：本实验室保藏，装液量 50mL（250mL三角瓶），初始pH调到6.5，灭菌后接入2mL种子液，温度30℃，摇床转速200r/min，培养72h。

1.1.2 培养基

（1）斜面培养基（PDA培养基）：葡萄糖2%，马铃薯20%，琼脂2%，pH值自然，115℃灭菌30min。

（2）液体种子培养基：ZnSO4·7H2O 0.1g/L，KCl 0.1g/L，葡萄糖 1.5g/L，牛肉膏 1.5g/L，pH 值自然，115℃ 灭菌30min。

（3）基础培养基：同1.1.2（2）。

1.1.3 主要仪器

生化培养箱：LRH－250A，广东省医疗器械厂；

全温度摇床柜：HYG－B，太仓市实验设备厂；

循环水多用真空泵：SHZ－3，上海沪西分析仪器有限公司；

立式压力蒸汽灭菌器：YXQ－LS－50SII，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；

单人单面净化工作台：SW－CJ－1FD，苏州净化有限公司；

分光光度计：UV－1600PC，上海美谱达有限公司。

1.2 分析方法

1.2.1 竹红菌素标准曲线的绘制 用紫外－可见分光光度计在465nm处测定一系列竹红菌素纯品（本实验室自制，纯度＞99%）无水乙醇溶液的吸光度，对竹红菌素溶液浓度y（mg/L）和相应的吸光值x进行线性回归，得到线性回归方程y＝0.126x＋0.001（R2＝0.999）。

1.2.2 竹红菌素含量测定 将一定量的菌丝与一定比例的无水乙醇混合，浸提24h，过滤后得到澄清提取液，用无水乙醇适当稀释定容后，采用分光光度法在465nm波长处测定吸光值［8］，根据回归方程计算竹红菌素的含量 （以下发酵液中竹红菌素含量均为浸提1次的数据）。

1.3 液体发酵培养基的优化方法

1.3.1 氮源筛选试验 以0.012mol/L的含氮量为标准，向基础培养基中分别加入的酵母膏、蛋白胨、酒石酸铵、氯化铵、硝酸铵代替基础培养基中的牛肉膏。

1.3.2 碳源筛选试验 以0.05mol/L的含碳量为标准，向基础培养基中分别加入蔗糖、果糖、可溶性淀粉、麦芽糖、乳糖代替基础培养基中的葡萄糖。

1.3.3 响应面设计 试验设计、数据分析及模型的建立均采用MATLAB软件进行，响应值为色素的产量。

2 结果与分析

2.1 氮源对竹黄菌发酵产色素的影响

由图1可知，有机氮源对竹黄菌发酵产色素更为有利，无机氮源对色素的合成有明显的抑制作用。有机氮源中蛋白胨对色素合成最为有利，所以选择蛋白胨作为竹黄菌发酵培养基的氮源。

图1 氮源对竹黄菌液态发酵的影响Figure 1 Effect of nitrogen sources on liquid fermentation of Shiraia bambusicola

2.2 碳源对竹黄菌发酵产色素的影响

由图2可知，碳源的种类对色素的合成有较大的影响，小分子的糖类比大分子糖类更有利于色素的合成，小分子糖类中以葡萄糖的效果最好，所以选择葡萄糖作为发酵培养基的碳源。

图2 碳源对竹黄菌液态发酵的影响Figure 2 Effect of carbon sources on liquid fermentation of Shiraia bambusicola

2.3 响应面试验结果的分析

以葡萄糖、蛋白胨为自变量，通过预试验确定自变量的水平取值（见表1）。

表1 响应面分析因素与水平Table 1 Factor and level of response sueface

响应面分析及结果见表2，响应面回归分析见表3，响应面影响因素方差分析见表4，响应面设计方差分析见表5。

表2 响应面分析方案和试验结果†Table 2 Result and design of response surface analysis

表3 响应面回归分析结果Table 3 Result of response surface analysis

表4 响应面影响因素方差分析Table 4 Result of response surface factor ANOVA analysis

运用MATLAB软件对试验所得数据进行拟合，得到二次多项式的回归方程：

经F检验，F（X1）＝27.47＞F0.01（3，7）＝5.89，F（X2）＝41.75＞F0.01（3，7）＝5.89，说明响应面分析的组成因素影响在α＝0.01是显著的，亦即试验因素对响应值y具有显著的影响。

表5 响应面设计方差分析Table 5 Result of response surface ANVOA analysis

经F检验，模型的F＝36.79＞F0.01（5，7）＝7.46，这表明了所得的拟合方程在α＝0.01的水平上是显著的，即响应值y与各试验因素之间存在显著的线性关系。

进一步对回归方程的各项回归系数进行显著性检验，方差分析的结果表明：各试验因素对响应值y的影响不是简单的一次线性关系，而是二次关系。交互项交互项F值较小说明了试验因素的相互作用不明显。失拟项F＝3.61＜F0.01（3，7）＝5.89，这说明失拟项不显著，该模型的决定系数R2＝0.963 3，表示方程能够解释96.33%的色素产量变化，综上所述，该模型方程能够代替试验真实点对试验结果进行分析。图3绘制出了响应面设计的三维图。

方程（1）中X21和X22的系数均为负数，方程抛物线的开口方向向下，所以方程存在最大值点。对方程（1）进行求导，解得响应值y取得最大时，葡萄糖的浓度为2.42g/L，蛋白胨的浓度为1.82g/L，此时模型的最大响应值为0.55g/L。为了证实响应面所得的预测结果，在上述所得两因子点进行了重复试验，得到的色素产量为（0.62±0.09）g/L，预测值和试验所得的数值之间具有良好的拟合性。由此证实了该模型的有效性。

图3 响应面立体曲面图Figure 3 3Dmap of response surface

3 结论

通过单因素试验确定培养基的最适氮源为蛋白胨，最适碳源为葡萄糖。蔡宇杰等［9］所做的固态发酵色素产量为40mg/L，陈佳佳等［10］从每升发酵液中获得色价为52的色素8g，但其发酵周期为96h，比本试验的发酵周期长。

1 王景祥.竹黄的研究概况［J］.中草药，1999，30（6）：477～479.

2 Yu J S，Xiao Y Y，Sheng Q R，et al.Natural colourant from shiraia bambusicola：Stability and antimicrobial activity of hypocrellin extract［J］.International Journal of Food Science and Technology，2009（44）：2 531～2 537.

3 张俭，马岚.竹红菌素研究的进展［J］.云南农业大学学报（自然科学版），2003，25（增刊）：184～188.

4 苏宇杰，印小艳，蔡宇杰，等.竹黄中竹红菌素的提取及稳定性研究［J］.食品添加剂，2009，30（2）：261～264.

5 Xiao H L，Yu J C，Xiang G L，et al.Isolation and identification of a new hypocrellin－producing stain shiraia sp.Super－h168［J］.Microbiological Research，2009（164）：9～17.

6 Yu J C，Xiao H L，Xian G L，et al.High－yield hypocrellin a production in solid－state fermentation by shiraia sp super－h168［J］.Appl.Biochem.Biotechnol，2010（160）：2 275～2 286.

7 梁晓辉，蔡宇杰，廖祥儒，等.竹黄发酵菌丝与竹黄子座成分比较分析［J］.食品与生物技术学报，2009，28（5）：705～708.

8 刘为忠，李聪，陈远腾，等.苝醌类化合物总量的测定［J］.云南化工，2000，27（2）：35～37.

9 蔡宇杰，张大兵，丁彦蕊，等.竹黄菌固态发酵竹红菌素条件的研究［J］.生物技术，2004，14（4）：46～47.

10 陈佳佳，李兆兰，焦庆才.竹黄无性株的液态发酵工艺研究［J］.中药材，20005，28（12）：1 049～1 051.

Optimization on submerged fermentation media of hypocrellin

HU Ming－ming1CAI Yu－jie1LIAO Xiang－ru1HU Yan1LI Zhi－ling2ZHANG Da－bing2

（1.School of biotechnology，Jiangnan University，Wuxi，Jiangsu214122，China；2.Jiangsu Hanbang Science＆Technology Co.Ltd，Huai’an，Jiangsu223001，China）

Hypocrellin were obtained by the submerged fermentation of shiraia bambusicola.Firstly，the suitable nutritional conditions of submerged fermentation for Shiraia bambusicola were determined through single factor test.The optimum fermentation culture was composed of Peptone and glucose.Then their optimum concentration was studied through response surface：Peptone 1.82g/L and glucose 2.42g/L.The production of hypocrellin was 0.62g/L in optimizing conditions.

hypocrellin；submerged fermentation；optimum the fermentation media

10.3969 /j.issn.1003－5788.2010.05.041

国家应用技术研究与开发资金政策引导类计划（编号：2009GJC10038）

胡明明（1985－），男，江南大学在读硕士研究生。E－mail：hmmhll＠163.com

蔡宇杰，廖祥儒

2010－06－01