有机酸提取鮰鱼皮胶原蛋白的工艺研究

陈丽丽赵 利刘 华邹胜员

（1.江西科技师范学院生命科学学院，江西 南昌 330013；2.江西省水产技术推广站，江西 南昌 330046）

有机酸提取鮰鱼皮胶原蛋白的工艺研究

陈丽丽1赵 利1刘 华1邹胜员2

（1.江西科技师范学院生命科学学院，江西 南昌 330013；2.江西省水产技术推广站，江西 南昌 330046）

采用酸法对鮰鱼皮中胶原蛋白进行提取，对提取胶原蛋白过程中酸的种类、酸的浓度、固液比、提取时间和提取温度对胶原蛋白提取率的影响进行研究。结果表明，酸法提取鮰鱼皮中胶原蛋白的最佳工艺为：0.5mol/L的醋酸作为浸提剂，采用1∶50（m∶V）的固液比，在15℃下提取72h，提取率最高为62.05%。同时，测定了鮰鱼皮中胶原蛋白的氨基酸组成。

鮰鱼皮；胶原蛋白；有机酸；提取

胶原蛋白是一种生物性高分子物质，具有良好的生物相容性、可生物降解性以及促进细胞生长的特性［1－3］，在动物细胞中扮演结缔组织的角色，对人体细胞、组织、器官具有增强、替代、修复、再生的作用，是需求量最大的一种生物医药材料，广泛应用于医药、化妆品、食品工业、生物合成等领域。

目前生产胶原蛋白制品的原料主要来源是猪、牛等陆生哺乳动物的皮、骨和肌腱，但因近年来随着全球生态环境恶化导致疯牛病、口蹄疫等许多流行病的发生，使得从陆生动物皮、骨中提取胶原蛋白的危险性增大［4］。因此，从水生动物鱼体废弃物中提取胶原蛋白已成为当前国内外许多学者研发的一个热门课题。随着淡水鱼产品的加工能力、产量和产值的逐年增长，淡水鱼加工废弃物的数量将越来越多［5］，如果不进行有效的处理，会造成资源的浪费和环境的污染，如何将其变废为宝，是一个亟待解决的问题。

本试验以鮰鱼皮为研究对象，采用有机酸法对鮰鱼皮中胶原蛋白的提取工艺进行了初步探讨。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鮰鱼皮：江西鑫海水产食品有限公司；

所有的化学试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器及设备

磁力搅拌器：JJ－1A，常州市华普达教学仪器有限公司；

数显恒温水浴锅：HH－4，江西省金坛市荣华仪器制造有限公司；

冷冻离心机：Evolution RC，上海中科伍佰豪生物工程有限公司；

紫外可见分光光度计：UV－1100，上海美谱达仪器有限公司；

电脑恒温层析柜：CXG－1，上海泸西分析仪器厂有限公司；

旋转蒸发器：N－1100，上海亚荣生化仪器厂；

冷冻干燥机：Labconco 2.5L，北京众益中和生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鮰鱼皮的预处理 取出冷冻的鮰鱼皮，流水化冻后，仔细将皮下肉、脂肪及结缔组织剔除，分切成碎片，用10%的异丙醇（1∶4）于4℃萃取24h，去除脂肪类物质，用去离子水清洗。然后在脱脂后的鱼皮中分别加入浓度为5%的氯化钠溶液（1∶10），于4℃连续搅拌24h，过滤，用去离子水（1∶10）水洗样品并过滤，重复3次，去除鱼皮中的非胶原蛋白。

1.3.2 鮰鱼皮中胶原蛋白的提取 鱼皮胶原蛋白的提取过程均在10℃以下进行。向预处理好的鮰鱼皮中加入一定量的醋酸、乳酸和柠檬酸试剂，连续搅拌一定时间，然后用高速冷冻离心机离心（10 000r/min，30min，10℃），得上清液即鱼皮胶原蛋白的提取液，冷冻干燥得到胶原蛋白。

1.3.3 胶原蛋白提取率的测定 胶原蛋白含有大量的甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、羟赖氨酸等，其中羟脯氨酸和羟赖氨酸在其他蛋白质中很少见［6］，为胶原蛋白所特有。通过测定羟脯氨酸的含量，然后乘以相应的系数就可以得到胶原蛋白的含量［7］。

量取1mL离心后的粗提液和6mol/L盐酸溶液10mL于水解管中，抽真空，用酒精喷灯封管，于110℃的烘箱中水解反应24h后，冷却取出。打开水解管的封口，将水解液移入旋转蒸发管中，蒸干盐酸，用去离子水稀释，定溶到100mL，摇匀，参照文献［8］测定羟脯氨酸的含量。胶原蛋白的提取率按式（1）计算：

1.3.4 醋酸提取胶原蛋白的正交试验 根据单因素试验结果，选取醋酸浓度、浸提时间、浸提温度和固液比为试验因子，以胶原蛋白的提取率为指标，采用L9（34）正交试验设计，进行酸法提取工艺研究。正交试验方案见表1。

表1 正交试验因素水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiment

1.3.5 氨基酸组成分析 氨基酸组成分析采用高效液相色谱法－AccQ.Tag柱前衍生法。冻干的胶原蛋白中加入6mol/L HCl后真空封管，置110℃烘箱水解24h。水解液加入AccG.Tag衍生剂进行衍生反应，然后将样品上柱分析。

1.3.6 胶原蛋白纯化方法 将鮰鱼皮胶原蛋白的提取液离心，得到上清液，加氯化钠至2.5mol/L进行搅拌盐析，然后冷冻离心（10 000r/min，20min，4℃），沉淀物以0.5mol/L的醋酸溶液复溶，复溶得到的胶原蛋白溶液对0.1mol/L醋酸溶液透析24h（1∶15，V/V，每4h换透析外液1次）后，对去离子水继续透析48h（1∶15，V/V，每4h换透析外液1次），冷冻干燥，得到奶白色胶原蛋白。

2 结果与分析

2.1 羟脯氨酸标准曲线的绘制

测定不同浓度的羟脯氨酸的A560值，绘制羟脯氨酸的标准曲线，结果见图1。

图1 羟脯氨酸的标准曲线Figure 1 Standard curve of hydroxyproline

由图1可知，羟脯氨酸标准样品的回归方程为Y＝0.058 8X＋0.008 2（R2＝0.999 3）。

2.2 有机酸提取鮰鱼皮胶原蛋白的单因素工艺

2.2.1 酸的种类对提取率的影响 分别以0.5mol/L的柠檬酸、乙酸和乳酸为浸提剂，固液比为1∶40（m∶V），在4℃浸提24h，考察不同酸对鮰鱼皮中胶原蛋白提取的影响，结果见图2。

图2 不同酸对鮰鱼皮中胶原蛋白提取的影响Figure 2 Effect of different acids on the extraction of collagen

由图2所示，3种酸中，醋酸对鮰鱼皮中胶原蛋白的浸提效果最好，提取率达到38.44%。因而，选用醋酸对其浸提鮰鱼皮中胶原蛋白提取工艺进行下一步的探讨。

2.2.2 醋酸浓度对鮰鱼皮中胶原蛋白提取的影响 分别以0.1，0.2，0.3，0.5mol/L醋酸为浸提剂，固液比为1∶40（m∶V），于4℃下浸提24h，考察醋酸浓度对鮰鱼皮中胶原蛋白提取的影响，结果见图3。

由图3可知，随着醋酸浓度的增加，胶原蛋白的提取率也增加，浓度超过0.5mol/L后，提取率增加很慢。醋酸浓度超过0.5mol/L时，胶原蛋白开始变性，导致提取率下降；醋酸浓度太低，胶原蛋白不能充分提取出来。因此，以0.5mol/L的醋酸为浸提剂较好。

图3 醋酸浓度对鮰鱼皮胶原蛋白提取的影响Figure 3 Effect of acetic acids concentration on the extraction of collagen

2.2.3 浸提时间对鮰鱼皮中胶原蛋白提取的影响 以0.5mol/L的乙酸为浸提剂，固液比为1∶40，于4℃下浸提24，48，72，96h，考察不同浸提时间对鮰鱼皮中胶原蛋白的影响，结果见图4。

图4 时间对鮰鱼皮中胶原蛋白提取的影响Figure 4 Effect of time on the extraction of collagen

由图4可知，在72h之内随时间的延长，胶原蛋白的提取率增加较快，但是超过72h，提取率增加不显著，为了提高效率，节约时间，选择72h为最佳浸提时间。

2.2.4 温度对鮰鱼皮中胶原蛋白提取的影响 以0.5mol/L的醋酸为浸提剂，固液比为1∶40（m∶V），于不同的温度下浸提72h，考察不同温度对鮰鱼皮中胶原蛋白提取的影响，结果见图5。

图5 温度对鮰鱼皮中胶原蛋白提取的影响Figure 5 Effect of temperatures on the extracton of collagen

由图5可知，在5～15℃之内，胶原蛋白的提取率变化很缓慢，温度高于15℃时，胶原蛋白的提取率明显降低。如果温度太低，在提取的过程中提取液很粘稠，分离较困难。因此，选择15℃为最佳提取温度。

2.2.5 固液比对鮰鱼皮中胶原蛋白提取的影响 以0.5mol/L的醋酸为浸提剂，在15℃下浸提72h，采用不同的固液比，考察固液比对鮰鱼皮中胶原蛋白提取的影响，结果见图6。

图6 料液比对鮰鱼皮中胶原蛋白提取率的影响Figure 6 Effect of solid－liquid ratio on the extraction of collagen

由图6可知，固液比越小，鮰鱼皮不能完全浸泡其中，提取率低，固液比高，对提取率的影响很小，反而造成胶原蛋白分离纯化困难，因此，提取鮰鱼皮中胶原蛋白的最佳固液比为1∶50（m∶V）。

2.3 醋酸提取鮰鱼皮中胶原蛋白的工艺条件的优化

选取4因子3水平正交组合试验L9（34），按照正交表确定的9个条件组合，对单因素试验结果进行正交设计优化。正交试验结果及方差分析分别见表2和表3。

表2 正交试验结果分析Table 2 Rusults and analysis of orthogonal experiment

由正交试验的极差分析和方差分析结果可知，用醋酸提取鮰鱼皮中胶原蛋白，各因素对鮰鱼皮中胶原蛋白提取率的影响程度依次为：酸浓度＞浸提时间＞温度＞固液比。最后得出最佳酸提取条件为0.5mol/L的乙酸作为浸提剂，采用1∶50（m∶V）的固液比，在15℃提取72h。经过验证实验，最佳条件下，胶原蛋白的提取率达到62.05%。4个因素中，酸浓度、浸提时间和温度对胶原蛋白的提取率影响显著。

表3 正交试验设计方差分析†Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment

2.4 鮰鱼皮中胶原蛋白的氨基酸组成分析

由表4可知，鮰鱼皮的酸溶性胶原蛋白纯化和未纯化样品的氨基酸组成差异很小，其中甘氨酸含量最多，分别为23.10% 和24.88%；必需氨基酸（赖氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸和苯丙氨酸）分别占总氨基酸的15.30%和16.77%，半必需氨基酸（精氨酸、组氨酸）分别占总氨基酸的10.50%和11.98%。据文献［9］记载鮟鱇鱼皮酸溶性胶原蛋白的必需氨基酸和半必需氨基酸分别占总氨基酸的13.46% 和5.75%。由此可见，鮰鱼皮的酸溶性胶原蛋白（ASC）是氨基酸的很好来源。

表4 鮰鱼皮中胶原蛋白的氨基酸组成Table 4 Amino acid composition of collagen from the skin of amiurus nebulosus

通常来说，胶原蛋白的半胱氨酸和色氨酸含量很低或没有［10］。鮰鱼皮ASC的色氨酸含量很低，仅为0.14%（未纯化的为0.31%），而半胱氨酸含量小于0.01%。亚氨酸（脯氨酸和羟脯氨酸）是胶原蛋白的特征性氨基酸，羟脯氨酸是脯氨酸在转译后由脯氨酸羟基化作用产生的［11］。鮰鱼皮的酸溶性胶原蛋白中亚氨酸含量为分别为21.82%和25.47%。与罗非鱼皮中胶原蛋白的25.4%很接近［12］，但高于草鱼皮中胶原蛋白的18.6%［13］。

3 结论

（1）本试验选择出最佳酸提取鮰鱼皮中胶原蛋白工艺条件，0.5mol/L的乙酸，固液比为1∶50（m∶V），15℃的条件下浸提72h，鮰鱼皮中胶原蛋白的提取率为62.05%。

（2）鮰鱼皮的酸溶性胶原蛋白纯化和未纯化样品的氨基酸组成差异很小，其中甘氨酸含量最多，分别为23.10%和24.88%；必需氨基酸（赖氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸和苯丙氨酸）分别占总氨基酸的15.30% 和16.77%，半必需氨基酸（精氨酸、组氨酸）分别占总氨基酸的10.50%和11.98%。

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Research on the extraction technology of collagen from amiurus nebulosus skin with organic acid

CHEN Li－li1ZHAO Li1LIU Hua1ZOU Sheng－yuan2

（1.School of Life Science，Jiangxi Normal University of Science and Technology，Nanchang，Jiangxi330013，China；2.Jiangxi Aquaculture Technology Spreading Center，Nanchang，Jiangxi330046，China）

The technology of extracted collagen from the skin of amiurus nebulosus was studied in the paper.The extraction technologies were studied，including the kind of acid，concentration of acid，immersion time and temperature.The optimal processing conditions were obtained by orthogonal experiments.The result showed skin of amiurus nebulosus was immersed in 0.5mol/L acetic acid（1∶50，m∶V）for 72hat 15 ℃，the ratio of the collagen extraction was 62.05%.Amino acid of collagen was determinated.

amiurus nebulosus skin；collagen protein；organic acid；extraction

10.3969 /j.issn.1003－5788.2010.05.034

农业部948“引进国际先进农业科学技术”（编号：2010－Z57）；江西省科技计划成果重点推广计划项目（编号：2009CCA01100P19－1）

陈丽丽（1986－），女，江西科技师范学院在读硕士研究生。E－mail：lilichen05＠163.com

赵利

2010－05－01