酶法提取襄麦冬总黄酮的单因素试验研究

孙永林 ，肖 俊，余海忠，汤尚文

（襄樊学院 化学工程与食品科学学院，湖北 襄樊 441053）

酶法提取襄麦冬总黄酮的单因素试验研究

孙永林 ，肖 俊，余海忠，汤尚文

（襄樊学院 化学工程与食品科学学院，湖北 襄樊 441053）

以襄麦冬为原料，通过单因素试验，采用酶法提取工艺对影响襄麦冬总黄酮提取的酶的添加量、酶解时间、酶解温度和介质pH值进行了研究. 结果表明影响襄麦冬黄酮提取的主要因素为：酶添加量40mg，酶解时间3h，酶解温度50℃，介质pH值为5.0.

襄麦冬；纤维素酶；总黄酮；单因素试验

襄麦冬为百合科山麦冬属(Liriope Lour.)植物湖北麦冬(Liriope spicata(Thunb.) Lour. Var. prolifera Y. T. Ma)的干燥块根，是湖北省道地药材，被收载于《中华人民共和国药典》(1995年、2000年、2005年版)山麦冬项下. 因主产区位于襄樊市所辖的襄阳区欧庙镇、老河口等县市，故名襄麦冬[1]. 总黄酮是襄麦冬主要活性成分之一，具有良好的抗炎、抗应激、抗组胺、心血管保护功能和磷酸化抑制等作用[2]. 传统的提取总黄酮的方法如水提、醇提等无法使包围黄酮类化合物的细胞壁破裂，存在巨大的传质阻力，致使提取效果受到限制[3]. 而纤维素酶能使细胞壁疏松、破裂，降低传质阻力，从而提高提取效率，且条件温和，环保无毒. 本文采用酶法提取工艺对影响襄麦冬总黄酮提取的酶的添加量、酶解时间、酶解温度和介质PH值进行研究，以期为襄麦冬的开发利用提供理论基础.

1 材料和方法

1.1 仪器、材料与试剂

UV-1750紫外可见分光光度计(日本岛津)；KQ2200(40KHz)台式超声波清洗器(江苏昆山)；襄麦冬(2010年3月采集于襄樊市欧庙镇GAP种植基地)；纤维素酶(武汉远城药业有限公司)，芦丁标准品(Sigma公司)，其它试剂如亚硝酸钠、硝酸铝等均为分析纯.

1.2 方法

1.2.1总黄酮的提取方法

1.2.1.1标准曲线的制作

准确称取经105℃干燥至恒重的芦丁20mg，置于250ml容量瓶中，用体积浓度为60%的乙醇稀释至刻度，摇匀，此标准溶液浓度为0.08mg/ml.分别吸取标准液0、0.5 ml、1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml于10ml容量瓶中，加入5% NaNO20.3 ml，摇匀，放置6min，加入0.3ml质量分数为10%的Al(NO3)3，摇匀、放置6min，再加入5%NaOH溶液4ml，加水至刻度，摇匀，静置10min，于分光光度计下扫描. 然后扫描麦冬黄酮提取液，测定发现两者均在291nm处有最大吸收峰. 以试剂空白作参比液，以芦丁浓度为横坐标、291nm处吸光度为纵坐标绘制标准曲线. 标准曲线如图1，其中y代表吸光度，x代表浓度. 得回归方程y = 26.096x + 0.0797，R2=0.9922，芦丁在0.005~0.041 mg/ml范围内线性关系良好.

图1 芦丁标准曲线

1.2.1.2 样品总黄酮含量的测定

称取1g干燥至恒温的襄麦冬粉末(过60目筛)装入试管，添加适量纤维素酶(以原料干重计)，添加蒸馏水10ml，置于水浴锅内升至所需温度，调整pH值，保持恒温一定时间后在沸水浴上灭酶10 min. 在样品中加入无水乙醇15ml（此时乙醇浓度为50%，料液比1:25），浸泡一段时间后，在常温下用超声波提取60min，布氏抽滤，用蒸馏水将浸提剂定容至50ml，移取0.5ml于100ml容量瓶中，加显色剂（NaNO2-Al(NO3)3-NaOH），用蒸馏水浸提剂定容至100ml，用紫外分光光度计测定样品的吸光度值，由标准曲线求得麦冬黄酮的浓度.

1.2.2 纤维素酶酶解单因素试验

1.2.2.1 酶的添加量对提取率的影响

取5只干燥试管，分别称取1g已达恒重的襄麦冬装入其中，分别加入10mg，20mg，30mg，40mg，50mg的纤维素酶(以原料干重计)，加水10ml，在水浴50℃下酶解2h，然后在90℃下灭酶10min，加入15ml无水乙醇提取60min，抽滤、显色，定容，以试剂空白为参比液，于291nm处测吸光值.

1.2.2.2 酶解时间对提取率的影响

取5只干燥试管，分别称取1g已达恒重的襄麦冬装入其中，加入30mg的纤维素酶(以原料干重计)，加水10ml，在水浴50℃下分别酶解1h，2h，3h，4h，5h，然后在90℃下灭酶10min，加入15ml无水乙醇，抽滤、显色，定容，以试剂空白为参比液，于291nm处测吸光值.

1.2.2.3 酶解温度对提取率的影响

取5只干燥试管，分别称取1g已达恒重的襄麦冬装入其中，加入30mg的纤维素酶(以原料干重计)，加水10ml，分别在水浴30℃，40℃，50℃，60℃，70℃下酶解2h，然后在90℃下灭酶10min，加入15ml无水乙醇，抽滤、显色，定容，以试剂空白为参比液，于291nm处测吸光值.

1.2.2.4 介质PH值对提取率的影响

取5只干燥试管，分别称取1g已达恒重的襄麦冬装入其中，加入30mg的纤维素酶(以原料干重计)，加水10ml，分别调节PH值为3，4，5，6，7，在水浴50℃下酶解2h，然后在90℃下灭酶10min，加入15ml无水乙醇，抽滤、显色，定容，以试剂空白为参比液，于291nm处测吸光值.

2 结果与分析

2.1 酶的添加量对提取率的影响

在其他因素不变的情况下，考查酶的添加量对黄酮提取率的影响，测定结果见图2. 由图2可知，随着加酶量的增加，提取率不断上升. 当加酶量达到40mg时，总黄酮提取率基本已达到最大值. 并得知，加酶量超过40mg后，提取率的变化不大，说明此时溶液中酶与底物浓度达到饱和状态. 因此采用加酶量为40mg为宜.

图2 酶的添加量对黄酮提取率的影响

图3 酶解时间对黄酮提取率的影响

2.2酶解时间对提取率的影响

在其他因素不变的情况下，考查酶解时间对黄酮提取率的影响，测定结果见图 3. 由于酶解时间与酶用量有较大关系，如果酶用量较大，则可适当减少酶解时间；而酶用量较少，其酶解时间相对较长. 由图3可知，随着时间增加，总黄酮提取率逐渐提高，4h时总黄酮提取率最大，可能大部分黄酮类化合物已溶出；再继续延长时间，浸出率反而下降，可能是因为黄酮类化合物的稳定性下降的缘故，因此酶解时间以4h为宜.

2.3 酶解温度对提取率的影响

在其他因素不变的情况下，考查酶解温度对黄酮提取率的影响，测定结果见图4. 温度对襄麦冬黄酮提取率的影响主要在于影响溶质的扩散和酶的活性. 纤维素酶通常在40℃~60℃时活性最强，温度过低，酶活性降低；而温度过高可使酶蛋白变性失活，丧失催化能力. 由图4可知，50℃以下，总黄酮浸出率随温度升高而增大，当温度达50℃时总黄酮浸出率最大；随后温度进一步升高，总黄酮浸出率逐渐减小，这是因50℃时纤维素酶发挥最大活性，有利于黄酮类化合物溶出，提高襄麦冬中总黄酮浸出率. 温度进一步提高，则不利于酶活力发挥.

2.4介质pH值对提取率的影响

在其他因素不变的情况下，考查介质pH值对黄酮提取率的影响，测定结果图5. 酶活性与pH值密切相关，pH值会影响酶活性、酶与底物的结合以及酶的稳定性. 纤维素酶的最适pH值一般为4.5~6.0，根据酶解底物不同会有相应的变化. 由图5可知，在酸性环境中纤维素酶活性较高，这是由于酶活力受pH影响较大，当pH为5时有利于复合酶发挥最大活力，破坏细胞壁，降低传质阻力，从而有利于襄麦冬中黄酮提取；过高或过低都不利于酶解作用，浸提效率较低.

3 结论

本次实验考察了影响纤维素酶作用的一些主要因素，酶添加量、酶解时间、酶解温度、介质pH值这4个因素对黄酮提取率的影响，结果表明影响襄麦冬黄酮提取的理想因素为：酶添加量40mg，酶解时间3h，酶解温度50℃，介质pH值为5.0.

襄麦冬中黄酮类物质向提取介质扩散时，必须克服细胞壁及细胞间质双重阻力. 由于细胞壁及细胞间质主要成分是纤维素等物质，本研究采用对纤维素具有专一降解作用的纤维素酶作用于植物材料，使纤维素等物质降解，减小细胞壁、细胞间质等传质屏障，促进了有效成分从细胞内向提取介质的扩散，且作用条件温和、可明显提高植物成分的提取效率[4-5]，因而采用酶法提取工艺为襄麦冬总黄酮的提取提供了一种新方法.

[1] 田 宏, 王蕾蕾. 湖北麦冬的生药鉴别[J]. 时珍国药研究, 1997, 8(6): 525-526.

[2] 余伯阳, 殷 霞, 徐国钧, 等. 湖北麦冬与浙麦冬质量的研究——免疫活性比较[J]. 中国中药杂志, 1991, 16(10): 584-585.

[3] 李 莉, 刘成梅, 田建文, 等. 现代提取分析技术在黄酮类化合物中的应用[J]. 江西食品工业, 2006, 22(4): 42-44.

[4] 张立娟, 余国萍, 周国华. 黑木耳多糖酶法提取条件的研究[J]. 食品研究与开发, 2005, 26(3): 89-91.

[5] 张巾英, 张明春. 应用纤维素酶提取中草药有效成分的研究进展[J]. 上海中医药杂志, 2007, 41(1): 79-81.

Extractting Total Flavonoids from Liriope spicata（Thunb.） Lour. var. prolifera Y. T .Ma by the Way of Single Factor Test and Enzymolysis Methods

SUN Yong-lin, XIAO Jun, YU Hai-zhong, TANG Shang-wen
（School of Chemical Engineering and Food Science, Xiangfan University, Xiangfan 441053, China）

Extractting total flavonoids from Liriope spicata（Thunb.）Lour. var. prolifera Y. T .Ma was studied by the way of single factor test and enzymolysis methods, including enzyme dosage, enzymolysis time, enzymolysis temperature and pH. The results showed the mainly effect on the extraction of the total flavonoids as follows: enzyme dosage 40mg , enzymolysis time of 3h, enzymolysis temperature of 50℃, medium pH 5.0.

Liriope spicata(Thunb.) Lour. var. prolifera Y. T. Ma; Cellulose enzyme; Total flavonoids; Single factor test

Q946

A

1009-2854(2010)08-0032-03

2010-07-16

湖北省教育厅中青年项目(Q20102601)

孙永林(1973— ), 女, 湖北襄樊人, 襄樊学院化学工程与食品科学学院讲师.

徐 杰）