分离鉴定一株具有免疫活性的海南红树林真菌

王 宇，安贵杰，喻 芳，牛莉娜，饶朗毓，裴 华*

（1.海南医学院2007级生物技术，海南 海口 571101；

2.海南医学院热带医学与检验医学院，海南 海口 571101）

·论 著·

分离鉴定一株具有免疫活性的海南红树林真菌

王 宇1，安贵杰1，喻 芳1，牛莉娜2，饶朗毓2，裴 华2*

（1.海南医学院2007级生物技术，海南 海口 571101；

2.海南医学院热带医学与检验医学院，海南 海口 571101）

目的 初探菌株PH0038发酵液的免疫增强活性，同时对菌株进行鉴定。方法 以人外周血单个核细胞增殖为指标，利用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测菌株的免疫活性。从菌株的菌落特征、形态特征、rDNA ITS序列及其系统发育分析对菌株PH0038进行鉴定。结果 PH0038的发酵液冻干成粉后，进行人外周血单个核细胞增殖实验，有较强的免疫增强活性，通过各种指标鉴定菌株PH0038为Penicillium sp.LF41。结论 菌株PH0038的发酵液可能对人体免疫系统有免疫增强效果。

真菌；免疫活性；鉴定

菌株PH0038是从海南省东塞港红树林国家自然保护区滩涂地的淤泥内分离得到的一株丝状真菌，经鉴定为Penicillium sp.LF41。海洋真菌能产生丰富多样的生物活性物质，因其生存环境条件恶劣，具有高盐、高压、低温、低照、寡营养等特点，使海洋生物产生了与陆地生物不同的代谢系统和防御体系，从而产生了相当部分陆地所没有的生物活性物质[1]。且其生物活性表现在能广泛刺激机体的特异性和非特异性免疫反应，改善机体免疫系统，提高自体免疫力[2]。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 土壤样品来源 海南省文昌市清澜港红树林区表土下5-20cm深度的土壤。

1.1.2 培养基 选择性分离培养基：海水马丁氏（Martin）培养基。发酵种子培养基。细胞培养基：含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基。

1.1.3 人外周血来源 从健康成人中随机抽取2ml EDTA-K2抗凝静脉血液。

1.2 方法

1.2.1 土样的处理与菌株的分离纯化 称取10g土壤样本加入含100ml无菌陈海水的锥形瓶中，充分振荡混匀后静置，取样本上清制备成10-2-10-4的不同稀释度，各取100μl涂布于分离培养基上，28℃培养，持续观察，挑取单菌落于海水马丁氏培养基平板中划线纯化，根据菌落的形态特征，排除相同菌株。以上操作在无菌环境下进行。

1.2.2 制备发酵上清液 取单菌落接种于发酵种子培养基，28℃，250r/min摇床培养5d，4℃3000r/min离心10min，取上清以0.22μm孔径滤膜过滤后备用。

1.2.3 活性菌株筛选 采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测样品对外周血单个核细胞的增殖效果。无菌条件下分离获得人外周血单个核细胞，调整浓度，使96孔细胞培养板内每孔中加入人外周血单个核细胞1×105个。在待测样本孔中加入经稀释后10-2浓度发酵培养液100μl，阳性对照孔内加入含5μg/ml PHA基础培养液100μl，阴性对照孔内加入基础培养液100μl，每个样本3个复孔。37℃，5%CO2培养72h后，加入含5mg/ml MTT基础培养液20μl，37℃，5%CO2培养。4h后弃培养上清，每孔中加入100μl DMSO，振荡器振摇10min，酶联免疫检测仪490nm波长进行测定，630nm参比波长。实验重复3次。

1.2.4 葡聚糖凝胶分离实验 取葡聚糖凝胶G-259-10g，纯水浸泡（4℃）过夜。取600mm×15mm层析柱，将泡发后G-25浇注，一次成型。取样本10ml，以纯水为上样液，肉眼观察样本走进柱后，收集下滴液弃去前10ml收集液。加上样液140ml，每7ml为1管，共收集20管，将收集物进行冷冻干燥。对冷冻干燥成份再次应用人外周血单个核细胞增殖刺激进行活性测定，实验重复3次。

1.2.5 菌株PH0038的分类鉴定 采用菌落形态和显微镜涂片观察，同时，结合分子生物学手段对菌株PH0038进行鉴定。

菌落形态特征：在马丁氏琼脂平板上点植，28℃倒置培养。观察并记录菌落性状、大小、是否产色素等[3]。

个体形态：采用革兰氏染色法观察菌株的形态特征。用光学显微镜观察菌丝大小、形状、表面特征及是否有横隔，孢子大小、形状、类型、颜色等，对照真菌鉴定手册[4]，确定菌株的种属地位。

1.2.6 rDNA ITS序列分析及其系统发育分析 基因组DNA的提取：直接用菌落PCR扩增目的DNA。

rDNA ITS序列扩增、测序：采用真菌通用引物，ITS-1和ITS-4。PCR扩增条件:95℃预变性5min，94℃变性40s，57℃退火40s，72℃延伸90s，35个循环，最后72℃延伸10min。测序工作由华大基因完成。

系统发育分析：将测序获得rDNA ITS序列通过Blast程序与GenBank中核酸数据进行比对分析（http://ncbi.nlm.nih.gov/blast)，并利用www.ebi.ac.uk生物信息网站上的Clustalw软件构建系统发育树，进行亲缘关系和系统发育分析。

2 结果

2.1 菌株的MTT筛选及活性检测结果 菌株PH0038经葡聚糖凝胶处理后，获得的第5管收集液有明显的显色成份，其冻干物呈淡黄色粉末状。将冻干后产物再次应用外周血单个核细胞增殖刺激实验测定，有明显的促进增殖效果。如表1。

2.2 菌株PH0038的分类鉴定

表1 MTT法检测葡聚糖凝胶分离后的有效产物对单个核细胞增殖的影响（±s)

表1 MTT法检测葡聚糖凝胶分离后的有效产物对单个核细胞增殖的影响（±s)

注：*待测样本与正常对照组比较P＜0.05。**待测样本与阳性对照组比较P＜0.05。

分组 第1次 第3次正常对照样本阳性对照0.229±0.0130.494±0.007*0.502±0.016**0.210±0.0080.482±0.006*0.513±0.018**

2.2.1 菌落形态 菌落呈圆形，绿色，表面为绒状，菌落背面培养基显褐色。

2.2.2 显微形态特征 菌株呈革兰氏阴性，光学显微镜下，菌丝有横隔，分生孢子梗亦有横隔，光滑。菌丝细胞垂直生出，近顶囊处稍膨大；顶囊短柱形,从顶囊的1/2至2/3处生出小梗，小梗双层，平行密集于顶囊顶部；分生孢子串生于小梗顶端,成辐射状排列或成柱形；分生孢子表面光滑无棘，球形或近球形。

2.2.3 rDNAITS序列分析及其系统发育分析rDNA提取和PCR扩增：采用菌落PCR直接进行扩增，获得一条约571bp大小的条带。

rDNA ITS序列分析：将该序列与GeneBank数据库中已收录的真菌rDNA进行Blast分析,结果表明,与PH0038菌株rDNA ITS序列间相似性较高的序列主要分布于青霉属，其中与之相似性最高的是青霉菌Penicillium sp.LF41，相似性为99%，由此推断菌株PH0038可能是青霉属中的一个种。

PH0038的rDNA ITS：序列系统发育进化树的构建将测得的rDNA ITS序列在GenBank中进行Blast分析，获得同源序列，从中挑取同源性高的18个菌的rDNA ITS序列，在www.ebi.ac.uk生物信息网站运用Clustalw软件构建包括相关种属的系统发育树。如图1，可知菌株PH0038与Penicillium sp.LF41亲缘关系最近。

图1PH0038rDNA ITS序列系统发育进化树

实验结果表明菌株PH0038的菌落形态特征及显微形态与青霉菌极为相近。rDNA ITS序列分析与系统发育分析表明菌株PH0038与青霉菌Penicillium sp.LF41亲缘关系最近，相似性为99%,由此鉴定菌株PH0038为Penicillium sp.LF41。

3 讨 论

对菌株PH0038的发酵液经葡聚糖凝胶初步分离后，做冻干处理，将冻干粉再次进行人外周血单个核细胞增殖实验，有较强的免疫增强效果。可见，从红树林特殊生态环境下分离得到的真菌，其活性物质为分泌型产物，体外实验有明显的免疫增强作用。

近年来，国内研究者对真菌的研究范围多集中于陆生真菌，尤其是大型食用真菌[5]，且活性物质主要来源于菌体细胞壁结构[6]，对于可能存在于微生物分泌物中的代谢产物研究较少[7]。菌株PH0038经形态学、基因测序鉴定为Penicillium sp.LF41，为青霉属，且国内外均未见关于青霉菌的免疫增强作用的报道。目前，我们正在对PH0038菌株的免疫活性物质进行分离纯化与结构鉴定，实验结果将另文报道。

[1]王祥敏,李 明,骆祝华,等.海洋真菌及其生物活性物质多样性研究[J].海洋湖沼通报,2007,3:69-74.

[2]李师鹏,安利国.真菌多糖免疫活性的研究进展[J].菌物系统,2001,20(4):581-587.

[3]魏景超.真菌鉴定手册[M].上海:上海科学技术出版社,1979:495.

[4]吴碧文,胡永华,方 哲,等.抗MRSA海绵真菌的分离及菌株W0707的鉴定[J].中国海洋药物杂志,2006,25(1):39-43.

[5]吴新君,毛培宏,金 湘,等.食(药)用真菌多糖的研究[J].化学与生物工程,2004,21（1）:14-16.

[6]冯 焱.真菌多糖免疫调节机能的研究进展[J].畜牧兽医科技信息,2003,19(5):24-26.

[7]熊 枫,郑忠辉,黄耀坚,等.从深海沉积物中筛选具有抗菌、抗肿瘤活性的海洋真菌[J].厦门大学学报,2006,45(3):419-423.

Isolation of mangrove endophytic fung with immunocompetence and identification of the strain PH0038.

WANGYu,AN Gui-jie,YU Fang,et al,School of Natural Sciences,Hainan Medical College,Haikou571101,Hainan,CHINA

Objective To identify the strain PH0038with better immune activities.Methods The immunocomptence was assayed by MTT method with peripheral blood mononuclear cells proliferation as indicator,the strain PH0038was identified by culture characteristics,morphological characteristics,rDNA ITS sequence and phylogenetic analysis.Results one fungu PH0038presents strong immunocomptence.The identification study indicated that PH0038was Penicillium sp.LF41.Conclusion The strain PH0038could enhance the human’s immune system.

Fungi;Immunocomptence;Identification

R379

A

1003—6350（2010）22—019—03

海南省自然科学基金项目（编号：309032）

王 宇(1989—)，女，内蒙古喀喇沁旗人，在读本科生。

*通讯作者：裴 华。E-mail：phzmh61@sohu.com

2010-10-15）