强电离放电·OH致死有害细菌的实验

武建芳,张芝涛,蔡丽娇

(大连海事大学环境工程研究所,辽宁大连 116026)

强电离放电·OH致死有害细菌的实验

武建芳,张芝涛,蔡丽娇

(大连海事大学环境工程研究所,辽宁大连 116026)

采用喷嘴对·OH进行载体喷雾定量杀菌实验,研究·OH的衰减程度及其对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌黑色变种的灭活作用;并通过测定不同浓度·OH对细菌作用后产生的脂质过氧化物量和蛋白质漏出量,研究了·OH对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌黑色变种细胞损伤的情况.结果表明:应用椎型喷嘴(孔径3.18 mm,水压0.49 M Pa)和扇型扇形喷嘴(孔径3.57 mm,水压0.63 M Pa)喷雾后的雾滴粒径可以有效地降低·OH衰减,对有害细菌的杀灭率都可达到《消毒技术规范》要求.

强电场放电;·OH;大肠杆菌;枯草芽孢杆菌黑色变种;载体喷雾定量杀菌

近年来,各种流行病异常狂獗,新传染疾病的种类和出现速度超过了以往任何时期,有害病菌的防范和杀灭已经成为人类生存的又一个重大挑战.目前,国内外有效的化学消毒产品主要有戊二醛[1]、二氧化氯[2]、环氧乙烷[3-4].这些产品总体存在的问题是:消毒作用慢;价格偏高;需要祛除残留,会造成二次污染;对人体有害,可能致癌;部分细菌出现了抗药性.

Hoigne[5]等人在1976年提出了以羟基自由基(hyd roxyl radical,·OH)产生为标志的先进氧化技术(AOP).强电离放电产生·OH的方法,不产生或极少产生副产品;·OH参与的反应属于游离基反应,它与微生物、有机物的反应速率常数在109L/(mo l·s)左右,反应速率快;·OH攻击有害生物以及各种污染物,降解为CO2,H2O及无机盐,没有二次污染.基于·OH的各种优点,其灭菌效果也有人报道[6],但·OH以喷雾的方式喷出,衰减严重,本文的创新点在于应用不同喷嘴,通过增加·OH雾滴粒径的方式,减小·OH衰减,来实现良好的杀菌效果.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 压力控制

通过直流稳压电源(RXN-3010D,兆信电子仪器)输出电压大小控制微型水泵(HSP11050-24V,成都为诚电子机械商行)的输出压力,实现压力参数改变.

1.1.2 喷嘴

PZ5070QZ:喷雾形状为锥形,喷孔直径2.00 mm,角度80°;WL 11/2-30 BSP:喷雾形状为锥形,喷孔直径2.77 mm,角度30°;WL 11/2-60 BSP:喷雾形状为锥形,喷孔直径2.77 mm,角度60°;WL 2-30 BSP:喷雾形状为锥形,喷孔直径3.18 mm,角度30°;WL2-60 BSP:喷雾形状为锥形,喷孔直径3.18 mm,角度60°.这5种喷嘴的角度能够完全覆盖图1中2,4,13位置,WL 11/2-30BSP,WL 11/2-60BSP和WL 2-30BSP,WL 2-60BSP能够达到考察不同喷洒角度对杀灭效果的影响.

PZ50100B:喷雾形状为扇形,喷孔直径2.00 mm,角度60°;NF20-30:喷雾形状为扇形,喷孔直径2.78 mm,角度60°;NF20-60:喷雾形状为扇形,喷孔直径2.78 mm,角度60°;N F30-30:喷雾形状为扇形,喷孔直径3.57 mm,角度60°;NF30-60:喷雾形状为扇形,喷孔直径3.57 mm,角度60°,不同的喷孔直径能达到在同样压力下改变喷雾雾滴粒径的目的,利用N F20-30,N F20-60和N F30-30,N F30-60能够考察不同喷洒角度对杀灭效果的影响,达到边角灭菌的目的.

1.2 实验方法

1.2.1 实验流程

为测量喷雾后·OH浓度及进行平面及空间实验,根据喷淋装置的可喷雾面积,特设计如图1实验装置.其规格为:每个小孔直径6 cm,2孔径圆心间距15 cm,2板间隔25.0 cm,面板长75 cm,宽45 cm,2支撑柱之间的距离横向42 cm,纵向42 cm.实验时分别将染菌片放置在各个标号处,用·OH溶液进行载体定量喷雾实验.

高浓度·OH溶液制取工艺流程如图2所示,白希尧[7]等采用特殊的电介质层,特殊的加工工艺,自制等离子体发生装置,O2和H2O通过预处理进入等离子体源,在强电场电离放电的作用下产生高浓度·OH, ·OH进入到新式气液溶解器中经充分溶解,使·OH高效地溶入溶液,含高浓度·OH的溶液再通过气液溶解分离器和剩余气体去除器,分离除去多余的气体后,便获得高浓度·OH溶液.

1.2.2 载体定量喷雾杀菌实验

大肠杆菌(Escherichia coli,A TCC 8099),枯草芽孢杆菌黑色变种(Bacillus subtilisvar.niger,ACTT 9372),购置于中国工业微生物菌种保藏管理中心.实验时取普通营养琼脂24 h新鲜培养物,用5 m L磷酸盐缓冲液(PBs)稀释成为(107～108)cfu/m L的悬液.取0.01 mL该菌悬液均匀涂于直径为12 mm直径圆形玻璃片,将染菌后的菌片放在直径为6 cm的无菌平皿内,每个平皿放3个,成三角形排列,将无菌平皿分别放在图1编号的不同位置上,用喷雾系统进行载体定量喷雾灭菌实验.每次实验重复3次.处理后的样片经充分振荡洗脱成菌悬液,取样进行活菌培养计数.灭菌效果以E表示,按下式计算[8].

式中:N0为阳性对照组样品生长菌落数;Nt为实验组样品生长菌落数.

1.2.3 膜脂质过氧化产物的测定

取108cfu/m L的菌悬液,加入一定量不同浓度的·OH溶液,立即混匀,95℃水浴煮沸40 min, 4 000 r/m in离心10 min,取上清液,参照TBA[9]比色法,吸取上清液于535 nm比色.

1.2.4 蛋白质含量的测定

取108cfu/mL左右的菌悬液,加入一定量不同浓度的·OH溶液,立即混匀,参照考马斯亮蓝法进行测定.

2 实验结果与讨论

2.1 不同锥形喷嘴影响下,·OH对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌黑色变种的作用效果

在水压0.49 M Pa,喷洒密度40.56μL/cm2,实验室温度9℃,湿度40%,原·OH质量浓度2.21 mg/L,在图1中2,4,13位置取样(实验结果采用平均值).研究了通过不同喷嘴将·OH喷雾后,·OH浓度衰减及灭菌情况.由图3可知,经5种不同喷嘴喷雾后,·OH的衰减分别为原来的0.28,0.35,0.38,0.40,0.42倍,原因是同样压力下,喷嘴孔径越大,雾滴粒径就越大,·OH衰减就越小;喷嘴的角度也影响·OH浓度衰减,由于喷嘴的角度小,使得杀灭位置处在喷雾范围的边缘,影响了灭菌效果.由图4可知,喷雾后·OH衰减越小,灭菌效果越好.WL2-60BSP喷嘴的灭菌效果最好,大肠杆菌初始对数值为5.71时,灭菌对数值为4.10;枯草芽孢杆菌黑色变种初始对数值为5.71时,灭菌对数值为2.93.

2.2 不同空间高度影响下,·OH对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌黑色变种的作用效果

在水压0.41 M Pa,所用喷嘴型号WL 2-60BSP喷洒密度40.56μL/cm2,实验室温度6℃,湿度40%,原·OH质量浓度2.28 mg/L,研究结果为图1中2,4,13位置取样实验结果的平均值,大肠杆菌初始对数值7.44,枯草芽孢杆菌黑色变种初始对数值6.54条件下.以一定高度喷洒·OH溶液并进行灭菌实验,在不同空间高度下取样后研究·OH浓度衰减程度及大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的死亡情况.由图5可知,随着空间高度的增加,·OH的衰减也逐渐增加;由图6可知,由于空间高度的增加导致·OH衰减,浓度逐渐下降,所以灭菌率也逐渐降低,但是在空间高度1.40 m的情况下喷雾杀菌,·OH的衰减仍然不是很大,所以在远距离也可以应用·OH灭菌.

2.3 不同扇形喷嘴影响下,·OH对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌黑色变种的作用效果

在喷头处水压为0.63 M Pa,喷洒密度为40.56μL/cm2,实验室温度为8℃,湿度为45%,研究结果为图1中7,9位置取样实验结果的平均值.由图7可知,经5种扇形喷嘴喷雾后,·OH的衰减程度和灭菌效果均有所不同,喷嘴孔径越大,·OH的衰减程度越小;原因是喷嘴孔径越大,喷雾雾滴粒径越大,·OH衰减就越小.喷嘴的角度也影响·OH浓度衰减,由于喷嘴的角度小,使得杀灭位置处在喷雾范围的边缘,影响了灭菌效果.由图8可知,由于不同扇形喷嘴喷雾后导致·OH衰减程度不同,对细菌的杀灭效果也不同,衰减越小,灭菌效果越好.大肠杆菌初始对数值为6.61时,NF30,NF50 2种喷嘴的灭菌效果均达到了100%杀灭.枯草芽孢杆菌黑色变种初始对数值为5.88时,NF30,NF50 2种喷嘴的灭菌对数值为3.63,3.82.

2.4 ·OH对细菌细胞通透性的影响

·OH作用于细菌,使膜壁受到损伤,导致蛋白质泄露.由图9可知,大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的蛋白质泄露量随着·OH质量浓度的增加都不断增加,说明·OH能够杀死细菌,并且导致蛋白质泄露.·OH质量浓度为0.84 m g/L时,大肠杆菌的蛋白质泄露量出现了降低的趋势,原因是当·OH质量浓度达到0.84 mg/L时,蛋白质的泄露量已经小于其被氧化的量,说明大肠杆菌已经大部分死亡,但是枯草芽孢杆菌的蛋白质泄露量还在逐渐增加,这也恰恰说明了枯草芽孢杆菌比大肠杆菌较难杀死.

2.5 ·OH对细菌脂质过氧化物含量的影响

·OH能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸(PUEA),引发脂质过氧化作用,并因此形成脂质过氧化物,如醛基(丙二醛MDA),因此,测试MDA的量可以反映生物体内脂质过氧化的程度,从而间接地反映出细胞的损伤程度[10-11].实验结果见图10,结果表明,·OH使大肠杆菌脂质过氧化,是大肠杆菌死亡的重要原因,并且随着·OH质量浓度的增加,破坏程度越严重.在·OH质量浓度为0.58 mg/L时,大肠杆菌的MDA含量出现了下降的趋势,可能的原因是·OH不但氧化破坏了细胞结构,而且将产生的丙二醛也氧化.

3 结论

·OH喷雾后灭菌效果主要取决于它的衰减程度,衰减越小,即·OH浓度越大,灭菌效果越好.·OH的衰减程度受喷雾雾滴粒径的影响,而雾滴粒径又由喷嘴的孔径和喷头处的水压决定.实验表明:1)WL 2-60BSP型喷嘴(孔径3.18,水压0.49 M Pa)和NF30,NF50型扇形喷嘴(孔径3.57,水压0.63 M Pa)具有相对最大的雾滴粒径,最小的·OH衰减,并且衰减后的·OH浓度可以有效杀灭有害细菌.2)在空间高度为140 cm时,·OH的衰减仍然可以满足灭菌要求.3)对强电场电离·OH灭菌机理的研究表明,·OH破坏细菌细胞结构,使蛋白质泄露,使细菌脂质过氧化,是大肠杆菌死亡的重要原因,随着·OH浓度增加,·OH还可能将细菌胞内物质直接氧化降解,完全破坏细菌细胞.

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Experimental on Killing Harmful Bacterium by the ·OH Produced by Strong-field Ion ization Discharge

WU Jian-fang,ZHANG Zhi-tao,CAILi-jiao
(Institute of Environmental Engineering,Dalian Maritime Univisity,Dalian 116026,China)

The experiment of carrier quantitative sp ray sterilization was conducted w ith sp ray nozzle to study the attenuation of hydroxyl radical and sterilization.The quantity of p rotein 1eakage and the p roduction of lipid peroxide in bacterial suspension killed by different concentration of hydroxyl radical were measured to analyse the inactivation mechanism s.The result show ed that verteb ral type of nozzle that diameter was 3.18 mm and p ressure was 0.49 M Pa could effectively reduce·OH decay,The same as the type of fan nozzle that diameter was 3.57 mm and p ressure was 0.63 M Pa.The killing rate of the harmful bacteria could achieve“sterilization technical specifications”requirement.·OH could damage bacterial p roteins,make the cellmembrane lipid peroxidation,and could damage the genetic material of bacteria.

strong-field ionization discharge;hydroxyl radical;Escherichia coli;Bacillus subtilisvar. niger;carrier quantitative sp ray sterilization

Q 89

A

1000-1565(2010)05-0551-05

2010-03-05

国家重点基础研究发展计划项目(2008CB41723)

武建芳(1982—),女,河北张家口人,大连海事大学在读硕士研究生,主要从事等离子体环境污染治理研究.

(责任编辑:梁俊红)