热休克蛋白90在硫化氢保护PC12细胞对抗化学性缺氧损伤中的作用

孟金兰，兰爱平，杨春涛，杨战利，王立伟，陈丽新，朱琳燕，陈培熹，冯鉴强

近年的研究表明［1］，硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)作为一种新型的气体信号分子，不仅具有神经调质的作用，而且也被视为一种重要的生理性保护成分，具有广泛的生物学效应。H2S不仅可保护鼠大脑皮层神经元对抗氧化应激的损伤［2］;亦具有抗神经元凋亡的作用［3，4］。有趣的是，当小鼠吸入H2S后能降低体内代谢约90%，然后进入“假死”状态［5］，由此而保护小鼠对抗随后致命的缺氧损伤［6］。但是H2S能否保护神经细胞对抗化学性缺氧引起的损伤尚未明确。

热休克蛋白(heat shock proteins，Hsp)是细胞受到各种理化因素刺激(包括缺氧)后诱导机体产生的一组保护性蛋白，包括Hsp90、Hsp70和Hsp40等。这些蛋白广泛存在于生物界的原核及真核生物细胞中，参与调节其多种靶蛋白(包括存活和凋亡因子)的折叠和结构稳定［7］。在缺氧条件下，Hsp90的表达上调可对抗心肌缺血/再灌注引起的损伤［8］。应用Hsp90抑制剂抑制其表达可增加心肌的缺血/再灌注损伤［9］，然而，H2S抗化学性缺氧的神经细胞保护作用是否与Hsp90信号通路有关，Hsp90在其中起何作用还不清楚。由此，本研究应用CoCl2(一种化学性低氧模拟剂)损伤具有神经元形态和功能特征的来源于大鼠嗜铬细胞瘤的PC12细胞，以建立化学性缺氧诱导的神经细胞损伤模型，拟探讨H2S能否对抗CoCl2引起的PC12细胞损伤及Hsp90在其中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 NaHS、氯化钴、17-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin，17-AAG)、Hoechst 33258 购自美国 Sigma Aldrich公司，CCK-8试剂盒购自日本Dojindo Lab，DMEM培养基购自Gibco公司。PC12细胞由中山大学实验动物中心提供。

1.2 细胞培养 PC12细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中。于37℃、5%CO2条件下培养，选取对数生长期细胞进行实验。

1.3 实验分组 实验分为6组:① 空白对照组(Control);② NaHS预处理组(PC):单独应用400 μmol·L－1NaHS处理PC12细胞3 h;③ CoCl2损伤组(CoCl2):应用600 μmol·L－1CoCl2处理 PC12 细胞48 h;④ PC+CoCl2;⑤ 17-AAG+PC+CoCl2:在应用 NaHS 前30 min，用2 μmol·L－1Hsp90 抑制剂17-AAG处理细胞30 min，其余的实验步骤与④ 组相同;⑥ 单独17-AAG 组(17-AAG):应用2 μmol·L－117-AAG处理PC12细胞30 min。

1.4 细胞存活率的检测 取对数生长期细胞，以1×104/孔接种于96孔板，在37℃、5%CO2条件下培养过夜后，更换为含有不同处理因素的培养基，每组设5个复孔。处理结束后各组细胞分别与CCK-8(每孔 100 μl加 10 μl CCK-8)37℃孵育 4 h，随后在酶联免疫检测仪测定每孔的吸收值(λ=450 nm)，按公式:存活率(%)=实验组OD/正常对照组OD×100%，求出实验组的存活率，重复3次。

1.5 Hoechst 33258核染色法检测细胞凋亡 把PC12细胞接种于24孔板内，按实验分组要求给不同的处理因素作用一定时间后，PBS洗两次，加入新鲜配制的4%多聚甲醛，4℃固定10 min，PBS漂洗后，加入5 mg·L－1Hoechst 33258试剂，室温轻摇10 min。在荧光显微镜(TE-2000，Nikon，Japan)下摄片，正常细胞核表现为弥漫均匀的低强度荧光，凋亡细胞核呈浓染致密固缩状态或颗粒状荧光。随机选取视野在荧光显微镜下摄片。

1.6 PI染色流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡细胞按实验要求给以不同的因素处理后，离心收集细胞，PBS洗两次，加入预冷的70%乙醇4℃固定过夜。用PBS洗两遍，PI染色后，用流式细胞仪检测细胞内DNA的含量(激发波长:488 nm;发射波长:610 nm)。每样本计数12 000个细胞，以DNA组方图中低于G1期DNA含量的亚G1峰的大小代表凋亡细胞数的多少。

1.7 Western blot法检测Hsp90的表达 细胞按实验分组给以不同的处理因素，离心收集。预冷的PBS洗涤两次，加入裂解缓冲液，4℃静置30 min。12 000×g离心10 min，取上清，采用BCA法进行蛋白定量。总蛋白经SDS-PAGE分离后，转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭1.5 h。随后加入Hsp90抗体(1∶1 000)，4℃孵育过夜，TBST洗3次，加入相应的二抗，孵育1 h，漂洗3次。将PVDF膜用发光试剂ECL显色后，用Image J 1.41o进行灰度分析，每样本重复3次。

1.8 统计学处理 实验数据经SPSS 11.0统计软件进行统计分析，数据用¯±s表示，统计方法采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 H2S减弱CoCl2诱导的细胞毒性作用 本文在预实验时证实600 μmol·L－1CoCl2能明显地损伤 PC12 细胞，因此，本研究中应用 600 μmol·L－1CoCl2作为CoCl2的有效损伤浓度。Fig 1显示，600 μmol·L－1CoCl2作用 PC12 细胞 24 h，对细胞具有明显的细胞毒性作用，使细胞存活率降低至(54.13±4.49)%，与对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。400 μmol·L－1NaHS 预处理 3 h 能对抗CoCl2的细胞毒性作用，使细胞存活率从(54.13±4.49)%提高至(79.42±3.29)%(P<0.01)。

Fig 1 Effects of different treatments on viability of PC12 cells(n=5)

2.2 H2S抑制CoCl2诱导的细胞凋亡作用 Fig 2的Hoechst 33258染色荧光显微镜照相术检测的结果显示，正常的PC12细胞呈现为散在的低强度荧光(Fig 2A)。凋亡细胞核则呈浓染致密的固缩状态或颗粒状荧光。600 μmol·L－1CoCl2作用 PC12细胞48 h，使凋亡细胞的数目明显增多(Fig 2C)。400 μmol·L－1NaHS本身不引起细胞凋亡(Fig 2B)，但能保护PC12细胞对抗CoCl2的致凋亡作用，使凋亡细胞数量减少(Fig 2D)。与上述实验结果相似，流式细胞检测的结果(Fig 3)显示，正常时，PC12细胞的凋亡数量很低，CoCl2却使细胞凋亡率增加至(38.8 ±1.27)%;400 μmol·L－1NaHS 预处理能使CoCl2诱导的细胞凋亡率降低至(15.1±0.47)%(P<0.01)。

Fig 2 Morphological changes in apoptotic cells of differentgroups assessed by Hoechst 33258 staining

2.3 H2S预处理上调Hsp90的表达 给予PC12细胞 NaHS 预处理，观察预处理后1、3、6、9、12 及 24 h Hsp90的表达情况。Western blot的检测结果显示，400 μmol·L－1NaHS预处理1 h ，可使 PC12 细胞Hsp90表达开始升高;在预处理3 h，Hsp90表达达到高峰，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01，Fig 4);随后，Hsp90的表达水平下降，作用24 h后，Hsp90表达恢复到对照水平，提示H2S预处理对Hsp90表达具有促进作用。

Fig 3 Effects of different treatments on apoptosis of PC12 cells(n=3)

Fig 4 Effects of H2S preconditioning onexpression of Hsp90 in different time(n=3)

值得注意的是 Fig 5显示，CoCl2(600 μmol·L－1)也能上调Hsp90的表达，而且，H2S预处理能进一步增强CoCl2对PC12细胞Hsp90表达的上调作用，提示 H2S的细胞保护作用可能与其上调Hsp90有关。

Fig 5 17-AAG on Hsp90 expression(n=3)

2.4 Hsp90介导H2S抗CoCl2诱导的细胞损伤作用 为了探讨Hsp90在H2S诱导的细胞保护中的作用，本文在NaHS预处理前30 min使用Hsp90抑制剂17-AAG(2 μmol·L－1)，观察对 Hsp90 表达及NaHS预处理诱导的细胞保护作用的影响。

Fig 5的Western blot结果显示，17-AAG可明显抑制H2S诱导的Hsp90表达增高。同时，17-AAG可明显拮抗H2S的细胞保护作用:在NaHS预处理前30 min加入2 μmol·L－117-AAG 后可使细胞存活率下降到(55.74±6.47)%(与H2S保护组相比，P<0.01，Fig 1);使细胞凋亡率再次回升到(34.5±0.48)%(与 H2S保护组相比，P<0.01，Fig 3);Hoechst 33258核染色形态学结果亦显示，17-AAG增加了细胞凋亡，减弱了H2S的细胞保护作用(Fig 2)。

上述结果提示Hsp90介导了H2S抗CoCl2诱导的细胞损伤作用。

3 讨论

最近，本实验室证实，H2S预处理能对抗化学性缺氧引起的心肌损伤［10］。本文再次证实，H2S预处理能保护具有神经元的形态和功能特征的PC12细胞对抗CoCl2引起的损伤作用。表明在不同的细胞模型，在体实验或离体实验，H2S均具有抗缺氧/缺血的细胞保护作用，这与曾因明课题组近期的研究结果相一致［11，12］。

新近研究表明，H2S能抑制缺血/再灌注引起的肝损伤，并增加Hsp90和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，提示H2S可通过上调Hsp90表达来保护肝细胞对抗缺血/再灌注损伤［13］。Hsp90是一种重要的细胞保护蛋白，可对抗包括缺氧/缺血等各种致死性的因素引起的细胞损伤［14］。研究表明，在心肌缺血区Hsp90高表达可保护心肌免受缺血/再灌注损伤;同时，过表达Hsp90也可抗心肌缺氧损伤［15］。

然而，Hsp90是否介导H2S抗化学性缺氧损伤的神经保护作用，至今未见报道。为了揭示两者的关系，本实验观察了400 μmol·L－1H2S供体NaHS作用PC12细胞不同时间对Hsp90表达的影响。本文发现，H2S预处理对PC12细胞Hsp90表达有明显的上调作用。表明H2S是一种有效激活保护性蛋白Hsp90的物质，这与 Jha等［13］的研究结果相一致。

为了进一步揭示Hsp90在H2S保护PC12细胞抗化学性缺氧损伤中的作用，本研究在NaHS预处理前30 min使用Hsp90抑制剂17-AAG。实验结果表明，Hsp90抑制剂17-AAG在抑制Hsp90表达的同时，能明显地阻断H2S的细胞保护作用，使PC12细胞存活率降低及凋亡率增加，提示Hsp90介导H2S诱导的神经保护作用，本实验为深入阐明H2S的神经细胞保护作用机制提供了新颖的实验依据。

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