人工养殖鲟鱼头中硫酸软骨素的提取工艺

户业丽 ，蔡焕焕 ，程波 ，吕中 ，曾琨琨 ，蓝泽桥

（1.武汉工程大学绿色化工过程省部共建教育部重点实验室，湖北 武汉 430073；2.湖北天峡鲟业有限公司，湖北 宜都 443300）

人工养殖鲟鱼头中硫酸软骨素的提取工艺

户业丽1，蔡焕焕1，程波1，吕中1，曾琨琨1，蓝泽桥2

（1.武汉工程大学绿色化工过程省部共建教育部重点实验室，湖北 武汉 430073；2.湖北天峡鲟业有限公司，湖北 宜都 443300）

对人工养殖鲟鱼头中硫酸软骨素采用稀碱法进行提取工艺的研究，以硫酸软骨素产率为考察对象，对影响产率的因素进行了单因素试验，并在此基础上通过正交试验，确定硫酸软骨素提取的最佳工艺。试验结果表明：提取硫酸软骨素的最佳工艺条件为NaOH浓度：0.06 kg/L、固液比：1/5（g/mL）、浸提温度：25℃、浸提时间：20 h。在此条件下硫酸软骨素的提取率为48.9%，其蛋白质和脂肪含量分别为0.980%和0.130%。

硫酸软骨素；鲟鱼头；提取工艺；正交试验

硫酸软骨素（Chondroitin sulfate，简称 Chs）在体内以蛋白聚糖聚集体的形式存在于软骨、腱、韧带和主动脉等组织中，是糖胺聚糖的一种[1]。作为一种天然的生物高分子化合物，硫酸软骨素具有促进冠状动脉循环、降血脂、抗病毒、抗凝血、抗肿瘤等生物活性[2-5]。此外，硫酸软骨素在医药、保健食品、美容化妆品等领域应用前景广泛[6-8]。

硫酸软骨素广泛分布于人和一些动物如猪、牛、羊和鱼等组织中，是动物的软骨、血管壁、皮肤等结缔组织的重要组成成分之一[1]。

鲟鱼是一种软骨硬鳞鱼[9]，除软骨本身之外，鲟鱼鱼头中富含软骨。对人工养殖鲟鱼的加工来说，鲟鱼鱼头是一种下脚料，而从人工养殖鲟鱼鱼头中提取硫酸软骨素鲜见文献报道，基于此，本文对人工养殖鲟鱼鱼头中硫酸软骨素的提取工艺进行研究，以期为鲟鱼资源的开发和综合利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

人工养殖鲟鱼鱼头：由天峡鲟业有限公司提供。

1.1.2 试剂

盐酸（AR）：信阳淮河化学试剂有限责任公司；氢氧化钠（AR）：天津市科密欧化学试剂有限公司；牛血清白蛋白（进口分装），考马斯亮蓝（进口分装）。

1.1.3 仪器

LD4-2A型低速离心机：北京医用离心机厂；eppendorf centrifuge 5417R型冷冻微量离心机；FD-1冷冻干燥机：北京博医康技术公司；TU-1800紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；BRUKER EQUINAX55傅里叶红外光谱仪。

1.2 方法

1.2.1 人工养殖鲟鱼鱼头制备软骨粉

取出冷冻的鲟鱼鱼头，流水化冻后，取出软骨，于70℃水浴中加热，除去脂肪及肉，再切成小块，50℃烘箱中干燥，粉碎得软骨粉，备用。

1.2.2 人工养殖鲟鱼鱼头中硫酸软骨素的提取

于磁力搅拌提取瓶中，加入一定量软骨粉，氢氧化钠溶液，在一定的温度下搅拌浸提，浸提完毕后以盐酸调pH6～7，离心，取上清。在上清液中加入2.5倍95%乙醇，于4℃放置过夜，离心，弃上清，沉淀加适量95%乙醇清洗，离心，收集沉淀，冷冻干燥，得白至浅黄色疏松状的固体，即硫酸软骨素。

1.2.3 人工养殖鲟鱼鱼头中硫酸软骨素的定性分析

1.2.3.1 硫酸软骨素中脂肪含量的测定

依据GB5009.6—85[10]，索氏抽提法测硫酸软骨素中脂肪的含量。

1.2.3.2 硫酸软骨素中蛋白质含量的测定

采用考马斯亮蓝法[11]对硫酸软骨素中蛋白质的含量进行测定。

蛋白质与考马斯亮蓝形成的复合物在595nm处有最大的光吸收，吸收强度与蛋白质浓度呈线性关系。将牛血清白蛋白配制成浓度（C，mg/L）分别为20、40、60、80、100 mg/L，与考马斯亮蓝溶液反应后，分别测其595 nm处的吸光度（A595）。然后，做C-A595图，得蛋白质标准吸收曲线，见图1，其线性回归方程为y=0.0031-0.012x（R2=0.9917）。

由标准曲线计算在不同条件下提取的硫酸软骨素中蛋白质的含量ε，见公式①

式中：ω为由标准曲线计算出的硫酸软骨素中蛋白质的含量，（mg/L）；w为硫酸软骨素的质量，g。

1.2.3.3 硫酸软骨素的光谱分析

采用KBr压片法对硫酸软骨素进行红外光谱测定，采用扫描法对硫酸软骨素进行紫外光谱测定。

2 结果与讨论

2.1 NaOH浓度对人工养殖鲟鱼鱼头中硫酸软骨素提取率的影响

按1.2.2操作,其它条件不变,改变NaOH浓度,考察NaOH浓度变化对硫酸软骨素提取率的影响,结果见图2。

由图2可知，在NaOH浓度低时，随NaOH浓度的增加，硫酸软骨素的提取率也随之增加；但NaOH浓度超过一定值后，再增加NaOH浓度，硫酸软骨素的提取率迅速降低。硫酸软骨素在蛋白聚糖聚集体中与蛋白之间以糖苷键相连，提取硫酸软骨素时，必须破坏多糖链与蛋白质的共价结合才能达到提取硫酸软骨素的目的，NaOH所起的作用就是一方面破坏糖苷键，另一方面降解蛋白质分子中的肽键，因此随其浓度增加，糖苷键和肽键不断地断裂，释放出硫酸软骨素，即硫酸软骨素的提取率增加；但浓度超过一定值后，再增加NaOH浓度，反应体系碱性增强，硫酸软骨素分子中的糖苷键也会降解，造成硫酸软骨素损失而使提取率降低，所以NaOH浓度应控制在0.06 kg/L左右。

2.2 软骨粉质量/NaOH溶液体积比对人工养殖鲟鱼鱼头中硫酸软骨素提取率的影响

按1.2.2操作,其它条件不变,改变软骨粉质量/NaOH溶液体积比（固液比）,考察固/液比变化对硫酸软骨素提取率的影响,结果见图3。

从图3中可以看出，液/料比的增加，硫酸软骨素的提取率也随之增加，但固液比超过1/5（g/mL），提取率增加有限，而反应体系的容积加大，在醇沉工序中，大量消耗乙醇，所以，从经济和清洁生产角度来说，固液/料比保持在1/5（g/mL）比较合适。

2.3 浸提温度对硫酸软骨素提取率的影响

按1.2.2操作,其它条件不变,改变浸提温度,考察浸提温度对硫酸软骨素提取率的影响,结果见图4。

由图4所示，浸提温度增加，在一定温度范围内可提高硫酸软骨素的提取率，但温度超过25℃后，随温度升高，硫酸软骨素分子中的糖苷键会降解，不仅造成提取率降低，还会使产品颜色变黄，所以浸提温度为25℃左右。

2.4 浸提时间对人工养殖鲟鱼鱼头中硫酸软骨素提取率的影响

按1.2.2操作,其它条件不变,改变浸提时间,考察浸提时间对硫酸软骨素提取率的影响,结果见图5。

由图5可知，适当地延长浸提时间，可提高硫酸软骨素的提取率，但浸提时间超过20 h后，再延长时间，硫酸软骨素提取率增加不多，反而会使产品外观变差，故浸提时间以20 h为宜。

2.5 正交试验确定人工养殖鲟鱼鱼头中硫酸软骨素提取的最佳工艺条件

为确定最佳提取工艺，采用L9（34）正交试验，以NaOH浓度、固/液比、浸提温度、浸提时间为试验因子（见表1），硫酸软骨素的提取率为指标进行正交试验，结果见表2。

表1 因素水平表Table1 The level of factors table

表2 正交试验的结果分析Table2 Resultanlysisoforthogonalexperiment

从表2可知：1）极差越大说明该因子的水平波动时，该因子对试验的结果影响就越大，因而按照极差的大小来决定因子的影响顺序为：NaOH浓度>浸提温度>浸提时间>固液比。2）最佳提取工艺的确定。k1，k2，k3反映了因子各水平对试验的影响，最大的k值对应着最好的水平。因此，鲟鱼鱼头中硫酸软骨素提取的最佳工艺条件为：NaOH 浓度：0.06 kg/L、固液比：1/5（g/mL）、浸提温度：25℃、浸提时间：20 h。在此条件下，硫酸软骨素的提取率为：48.9%（相当鲟鱼头软骨粉质量）。

2.6 人工养殖鲟鱼鱼头中硫酸软骨素的质量分析

2.6.1 硫酸软骨素中蛋白质的含量

称取硫酸软骨素0.100 g,定容至25 mL水中，按1.2.3.2操作（每组取3个样，每个样品测3次），取平均，代入公式①，计算得硫酸软骨素中蛋白质的含量为0.980%。

2.6.2 硫酸软骨素中脂肪的含量

按1.2.3.1操作，采用索氏抽提法测硫酸软骨素中粗脂肪的含量为0.130%。

2.6.3 硫酸软骨素光谱分析

采用KBr压片法，对硫酸软骨素在400 cm-1～4000 cm-1进行扫描，得到硫酸软骨素的红外吸收光谱，见图6。

在200 nm～400 nm进行扫描，得到硫酸软骨素的紫外吸收光谱，见图7。

由图6可知：在3470 cm-1附近有一宽的强吸收峰，为糖环上羟基的伸缩振动所引起的，在2926 cm-1附近有糖分子中C-H伸缩振动的特征峰，在1658 cm-1附近有乙酰氨基的N-H伸缩振动，在1131 cm-1和1072cm-1附近有C-O伸缩振动，在1259cm-1和827cm-1附近有硫酸基团的振动，说明样品中含有硫酸软骨素所有乙酰氨基、羧基、硫酸基、和糖环等官能团。

由图7可知：样品在268 nm～280 nm之间无核酸和蛋白质的吸收峰，而在220 nm附近有糖的吸收，且峰型尖锐，说明硫酸软骨素样品中核酸和蛋白质杂质含量少。

3 结论

1）首次对人工养殖鲟鱼鱼头中硫酸软骨素的提取工艺进行了研究，用稀碱法提取得到了硫酸软骨素,为人工养殖鲟鱼资源的综合利用提供了依据。

2）在单因素试验的基础上设计了正交试验，正交试验表明：各因子对鲟鱼头中硫酸软骨素提取率的影响大小为：NaOH浓度>浸提温度>浸提时间>料液比；鲟鱼鱼头中硫酸软骨素提取的最佳工艺条件为：NaOH浓度：0.06 kg/L、固液比：1/5（g/mL）、浸提温度：25 ℃、浸提时间：20 h。在此条件下，硫酸软骨素的提取率为：48.9%（相当鲟鱼头软骨粉质量）。

3）对提取的硫酸软骨素进行了蛋白质含量和的脂肪含量分析，结果表明硫酸软骨素中蛋白质和脂肪的含量分别为0.980%和0.130%。

4）硫酸软骨素的光谱分析表明，提取的硫酸软骨素样品中核酸和蛋白质杂质含量少。

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Study on Extraction Technology of Chondroitin Sulfate from the Head of Farmed Sturgeon

HU Ye-Li1,CAI Huan-Huan1,CHENG Bo1,LüZhong1,ZENG Kun-kun1,LAN Ze-qiao2
（1.Key Laboratory for Green Chemical Process of Ministry of Education＆Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430073，Hubei,China;2.HuBei Tianxia Sturgeon Company，Yidu 443300，Hubei，China）

Extraction technology of chondroitin sulfate from the head of farmed sturgeon was studied by dilute alkali,extraction rate of chondroitin sulfate was as a study object,single factor experiment and orthogonal experiment was carried out.The results show that the optimal condition of extraction was 0.06 kg/L of concentration of NaOH,the ratio of cartilage powder and the volume of sodium hydroxide is 1/5（g/mL）,25℃of temperature,and 20 h of extraction time.The extraction rate of chondroitin sulfate was 48.9%under the said condition.The content of protein and fat of chondroitin sulfate was 0.980%and 0.130%respectively.

chondroitin sulfate；the head of sturgeon；extraction technology；orthogonal experiment

09年湖北省基础化学示范中心资助

户业丽（1963—），女（汉），副教授，硕士，主要从事生物活性物质的分离、纯化及活性研究工作。

2009-07-05