IL-27对哮喘小鼠气道炎症的影响

赵云峰，梁栋，张梅，吴学玲

支气管哮喘（以下简称哮喘）主要是在过敏原刺激下，Th2免疫反应增强、Th1免疫反应减弱所致的复杂病理过程，嗜酸性粒细胞、T 细胞及其细胞因子在哮喘整个病理过程中起着重要的作用。近年来研究显示：细胞因子白细胞介素 27（IL-27）可以增强 Th1免疫反应、减弱 Th2免疫反应[1]；抑制过度的炎症反应[2]。IL-27 在哮喘的病理过程中扮演着重要角色。本研究应用卵白蛋白（OVA）建立哮喘小鼠模型，在OVA 致敏后的第 28～30 天，连续 3 d 每天滴鼻给予 IL-27，观察小鼠肺组织病理学改变、计数支气管肺泡灌洗液（BALF）中嗜酸性粒细胞数量，测定 BALF 中细胞因子 IL-4、IFN-γ 浓度，测定肺组织 T-bet mRNA表达量，旨在研究 IL-27 对哮喘小鼠气道炎症的影响及可能机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂及仪器 卵白蛋白（ovalbumin，OVA，V 级）购自美国 Sigma公司；氢氧化铝粉购自上海浦山化工公司；小鼠 IL-4、IFN-γ ELISA试剂盒购自深圳晶美科技有限公司；小鼠 T-bet 及β-actin 检测引物由上海博亚生物工程有限公司合成；逆转录酶、Taq 酶及缓冲液购自美国 Promega公司；重组IL-27 由日本 Hyogo 大学 Yoshimoto教授惠赠。光学显微镜由日本 Olympus公司制造；低温冰箱由日本 Sanyo公司制造；离心机由美国Beckman公司制造。

1.1.2 实验动物分组和模型制备 选择 5～6周龄，清洁级健康 BALB/c 雌性小鼠 24只，重量12～16 g，东南大学医学院实验动物中心提供。动物房温度波动于20～24 ℃，湿度 70%，普通光照，自由饮水，喂食小鼠专用饲料。24只小鼠按随机数字法随机分为生理盐水组、哮喘组及IL-27组，每组8只。①哮喘小鼠模型的建立：每只小鼠于第 1、14、21 天腹腔注射 0.1% OVA 0.1ml、100 g/L氢氧化铝 0.2ml 进行致敏，第 28～30 天连续 3 d用 3 g/L 戊巴比妥钠 0.3ml 腹腔注射麻醉小鼠后，1% OVA 溶液 50 μl 滴鼻激发；②生理盐水组小鼠：方法和步骤同上，采用生理盐水代替 0.1%OVA；③IL-27组小鼠：在OVA 致敏的第 28～30 天，IL-27组小鼠分别给予 1 μg IL-27（溶于50 μl PBS 中）滴鼻[1]，其余处理同哮喘小鼠模型的建立，但 IL-27 滴鼻过程早于OVA 滴鼻激发过程10 min。

1.2 方法

1.2.1 计数 BALF 中嗜酸性粒细胞数量 最后1 次滴鼻激发 48 h 后对小鼠进行相应处置。每只小鼠给予 3 g/L 戊巴比妥钠 0.3ml 腹腔注射麻醉小鼠，行气管切开及气管插管，缝线牢固结扎，用pH 值 7.4的PBS 液对右侧支气管肺泡进行灌洗并收集 BALF，每次注入 1ml PBS 液，反复冲洗2 次后吸出，共 3 次，回收率 80% 以上。将收集的BALF 摇匀，离心半径为5.8 cm，以 1000 r/min的速度离心 5 min，沉淀物涂片，HE 染色后在400倍放大倍数下，至少数 500个细胞，根据形态学计数嗜酸性粒细胞，将 BALF 上清液留取 1ml 置于–70 ℃ 温度保存，待测 BALF 中 IL-4、IFN-γ浓度。

1.2.2 肺组织标本处理 右侧支气管肺泡灌洗完毕后，无菌操作下切取左侧部分肺组织，4% 多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片进行 HE 染色。留取部分左侧肺组织–70 ℃ 保存用于T-bet mRNA测定。

1.2.3 BALF 中细胞因子的测定 IL-4和IFN-γ采用 ELISA 测定，具体方法按照 ELISA 试剂盒内说明书操作。

1.2.4 RT-CPR 测定肺组织中 T-bet mRNA 表达 提取肺组织总 RNA，引物序列为：正义链：5’2 TGC GGA GAC ATGCTG ACC 23’，反义链：5’2 TGA GCC CCA CTT GAA CCA 23’。RT 反应体系20 μl，PCR 反应体系 50 μl。PCR 扩增反应条件为：95 ℃ 预变性 5 min，94 ℃ 变性 30 s，58 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸 1 min，循环 30 次，72 ℃ 终末延伸 10 min。各组样品同时扩增 β-actin 作为内参照。PCR 产物行 1% 琼脂糖凝胶电泳，结果用凝胶成像系统扫描存盘。片段分子量大小经核酸分子量 Marker 证实。采用 Quantity One 图像分析系统分析并计算目的条带与β-actin 条带吸光度积分灰度值比值，以灰度值比值作为T-bet mRNA的表达水平。实验重复 3 次。

1.3 统计学处理

采用 SPSS13.0 统计软件，实验中各项指标的所有数据均采用表示，各组间比较采用方差分析及q 检验率的比较采用 χ2检验，相关性分析采用直线相关分析。以 P＜0.05 为对比组之间的差异有统计学意义，P＜0.01 为对比组之间的差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠肺组织病理形态学改变

HE 染色可见生理盐水组小鼠支气管管腔光滑，上皮完整，气道黏膜无水肿，肺泡间隔正常，气道及血管周围见少量嗜酸性粒细胞浸润。哮喘组小鼠气道黏膜明显水肿，黏膜基底层增厚，杯状细胞增多，支气管管腔缩小，部分可见黏液栓，气道周围血管扩张充血，气道黏膜层、黏膜下层、血管周围组织、肺泡壁及肺泡腔内有大量炎性细胞浸润，以嗜酸性粒细胞为主，肺泡隔显著增厚。IL-27组小鼠气道黏膜无明显水肿，管腔无缩小，气道黏膜有少量嗜酸性粒细胞浸润，较哮喘模型组明显为少，肺泡间隔未见异常。

2.2 3组小鼠 BALF 中嗜酸性粒细胞的比较（见表1）

表1结果显示：哮喘组小鼠 BALF 中嗜酸性粒细胞计数及嗜酸性粒细胞占白细胞总数百分比均显著高于生理盐水组小鼠（P 均＜0.01）；而IL-27组小鼠 BALF 中嗜酸性粒细胞计数及嗜酸性粒细胞占白细胞总数百分比均显著低于哮喘组小鼠（P 均＜0.01）。

表1 3组小鼠 BALF 中嗜酸性粒细胞数量及嗜酸性粒细胞百分比的比较（ ，n=8）Table1 Comparison of eosinophil and the percentage of eosinophil with white blood cell in BALF among three groups( , n=8 )

表1 3组小鼠 BALF 中嗜酸性粒细胞数量及嗜酸性粒细胞百分比的比较（ ，n=8）Table1 Comparison of eosinophil and the percentage of eosinophil with white blood cell in BALF among three groups( , n=8 )

注：a与生理盐水组比较，P＜0.01；b与哮喘组比较，P＜0.01Notes: aCompared with NS group, P＜0.01; bCompared with asthma group, P＜0.01.

组别Groups嗜酸性粒细胞（×107/L）Eosinophil (×107/L)嗜酸性粒细胞百分比（%）Percentage of eosinophil (%)生理盐水组NS group 1.09±0.11 4.2±0.8哮喘组Asthma group 12.82±2.17a 18.6±2.7a IL-27组IL-27 group 2.21±0.33b 7.3±1.2b

2.3 3组小鼠 BALF 中 IL-4、IFN-γ 浓度的比较（见表2）

表2结果显示：哮喘组小鼠 BALF 中 IL-4浓度明显高于生理盐水组，IFN-γ的浓度明显低于生理盐水组（P＜0.05）；而 IL-27组小鼠 BALF 中IL-4 浓度明显低于哮喘组，IFN-γ 浓度明显高于哮喘组（P＜0.05）。

表2 3组小鼠 BALF 中 IL-4、IFN-γ 浓度的比较（ ，n=8）Table2 Comparison of IL-4, IFN-γ concentration in BALF among three groups ( , n=8)

表2 3组小鼠 BALF 中 IL-4、IFN-γ 浓度的比较（ ，n=8）Table2 Comparison of IL-4, IFN-γ concentration in BALF among three groups ( , n=8)

注：a与生理盐水组比较，P＜0.05；b与哮喘组比较，P＜0.05Notes: aCompared with NS group, P＜0.05; bCompared with asthma group, P＜0.05.

组别 Groups IL-4 (μg/L) IFN-γ (μg/L)生理盐水组 NS group 25.6±2.7 36.5±5.2哮喘组 Asthma group 61.3±13.1a 11.1±3.3a IL-27组 IL-27 group 20.4±3.2b 50.3±6.3b

2.4 3组小鼠肺组织 T-bet mRNA 表达量的比较（见图 1）

图1结果显示：哮喘组小鼠肺组织 T-bet mRNA 表达量（吸光度积分比值）（0.130±0.012）较生理盐水组（0.342±0.038）明显下降（P＜0.05），而 IL-27组小鼠肺组织 T-bet mRNA 表达量（0.268±0.048）明显高于哮喘组小鼠（P＜0.05）。

图1 3组小鼠肺组织 T-bet mRNA 表达量的比较Figure1 Comparison of T-bet mRNA expression in lung among three groups

2.5 相关性分析

哮喘组小鼠肺组织 T-bet mRNA 表达量与BALF 中嗜酸性粒细胞数量及IL-4 浓度均呈负相关（r 分别为–0.672、–0.732，P 均＜0.05）、与BALF 中 IFN-γ 浓度呈正相关（r=0.593，P＜0.05）；IL-27组小鼠肺组织 T-bet mRNA 表达量与BALF 中嗜酸粒细胞数量及IL-4 浓度均呈负相关（r 分别为–0.564、–0.798，P 均＜0.05）、与BALF 中 IFN-γ 浓度呈正相关（r=0.739，P＜0.05）。

3 讨论

IL-27是 2002年发现并命名的IL-6/IL-12细胞因子家族成员之一，由 EBI3（IL-12p40 相关蛋白）和p28（IL-12p35 相关多肽）两个亚基构成异源二聚体[2]。研究发现 IL-27 主要由细菌激活的抗原递呈细胞通过 CD40/CD40L的相互作用表达释放[3]，它的表达与变应原和炎症刺激有关[4]。

T-bet是 Th1细胞分化过程中具有核心作用的转录因子。研究发现 IL-27 可以使 T-bet mRNA表达量增强，增强 Th1细胞分化、抑制 Th2细胞分化。在野生型 CD4+T 细胞中 IL-27 可以诱导T-bet和IL-12 受体 β2亚单位（IL-12Rβ2）表达增殖[5]，一方面 IL-27 激活初始 CD4+T 过程中，信号转导转录激活因子 1（STAT1）被磷酸化而激活[4]，激活的STAT1 诱导激活下游的T-bet，进而诱导 IL-12Rβ2表达，使初始 T 细胞获得对 IL-12的反应性[6]，促进 Th1细胞分化；另一方面 IL-27通过上调 ICAM-1 表达，然后与初始 CD4+T 表面LFA-1结合使 T-bet 表达显著增强，促进 Th1细胞分化。IFN-γ是重要的Th1细胞因子，IFN-γ 可以反馈激活 T-bet，增强 Th1免疫反应，抑制 Th2免疫反应，在没有 IL-12和IFN-γ 存在时，IL-27激活 STAT1，通过 JAK1- STAT1 途径促进 IFN-γ产生[1]。另外，IL-27 不仅抑制 Th2细胞分化，而且在免疫反应中抑制 IL-4、IL-5、IL-13等细胞因子分泌[1]，抑制 Th2免疫反应。因此，IL-27 在抑制 Th2免疫反应的同时促进 Th1免疫反应的产生[7]。

本研究结果显示：与生理盐水组小鼠相比较，哮喘组小鼠肺组织炎症反应明显加重、有较多嗜酸性粒细胞浸润；肺组织 T-bet mRNA 表达量明显减少；BALF 中嗜酸性粒细胞数量及嗜酸性粒细胞占白细胞总数百分比明显升高，而且 BALF 中 IL-4浓度明显升高、IFN-γ 浓度明显降低；说明哮喘组小鼠存在Th2免疫反应亢进、Th1免疫反应减弱，哮喘组小鼠气道、肺组织有明显的炎症反应及T-bet mRNA 表达量的减少。

IL-27组小鼠与哮喘组小鼠比较，肺组织炎症反应明显减轻；肺组织 T-bet mRNA 表达量明显增高；BALF 中嗜酸性粒细胞数量及嗜酸性粒细胞占白细胞总数百分比明显下降；BALF 中 IL-4 浓度明显降低、IFN-γ 浓度明显升高；另外，哮喘组、IL-27组小鼠肺组织 T-bet mRNA 表达量与BALF 中嗜酸性粒细胞数量及IL-4 浓度均呈负相关、与BALF 中 IFN-γ 浓度均呈正相关。以上结果表明 IL-27 可能通过增强肺组织 T-bet mRNA表达量从而增强 Th1免疫反应、抑制 Th2免疫反应，减少哮喘小鼠肺组织及BALF 中嗜酸性粒细胞数量，进而减轻哮喘小鼠肺组织炎症反应。

总之，IL-27能明显减轻哮喘小鼠肺组织炎症反应、减少 BALF 中嗜酸性粒细胞数量，可能与其增强哮喘小鼠肺组织 T-bet mRNA 表达、增强Th1免疫反应、抑制 Th2免疫反应有关，因此，IL-27 对哮喘的防治具有广阔的应用前景。

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[5]Huber M, Steinwald V, Guralnik A, et al.IL-27 inhibits the development of regulatory T cells via STAT3.Int Immunol, 2008,20(2):223-234.

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