β雌激素受体沉寂表达载体的构建及表达

孙旭妍，陶敏芳，程蔚蔚，王玉东

自雌激素受体（ER）β亚型被克隆出来后，体外实验发现2种ER亚型在成骨细胞内均有表达，经脱氢表雄酮（DHEA）体外作用后，成骨细胞 ERα亚型的转录水平无明显变化，而 ERβ亚型的转录水平则明显增高，且骨保护因子（OPG）与ERβ的转录水平呈线性正相关[1-2]。由于天然雌二醇（E2）与ERα和ERβ的活化蛋白-1（AP-1）位点结合后，可表现出不同的信号转导：与ERα结合后激活转录，而与ERβ结合后则抑制转录[3]。因此，我们尝试在体外利用小干扰RNA（siRNA）技术构建 ERβ 沉寂表达载体，以明确 ERβ是否在防治绝经后骨质疏松中发挥主要作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与质粒 人成骨 hMG63 细胞株购自美国模式菌种收集中心（ATCC），慢病毒载体系统购自日本 Toyobo公司，该载体系统由含有 H1 启动子和可调控 GFP 表达的EF1-alpha 启动子的pLVTHM-GFP 质粒，以及含有病毒包装所必需元件的pRsv-REV、pMDlg-pRRE和pMD2G 质粒组成。

1.1.2 主要试剂与仪器 总RNA提取试剂（Trizol Reagent）购自日本 TaKaRa公司；第一链cDNA 合成试剂盒（ReverTra Ace-α First Strand cDNA Synthesis Kit）、Realtime-PCR 试剂盒（QPK-101）、T4 DNA 连接酶和LGK-100 核酸电泳仪均购自日本 Toyobo公司；限制性内切酶 MluI、ClaI购自宝生物工程（大连）有限公司；大肠杆菌 E.coli DH5α 感受态细胞购自美国 Invitrogen公司；100 bp DNA ladder（M-DNA-100 bp）购自美国 Axygen公司；恒温水浴锅和Fine-do X1 数码凝胶图像处理系统购自上海天能科技有限公司；Eppendorf RealPlex4 Realtime-PCR 仪购自德国Eppendorf公司；其他生化试剂均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2 方法

1.2.2 ERβ-shRNA 慢病毒载体的构建 将合成的DNA Oligo 稀释后退火形成 shRNA 双链DNA，与pLVTHM-GFP 质粒分别用 MluI、ClaI双酶切后，以 T4 DNA 连接酶进行连接，连接产物转化大肠杆菌 E.coli DH5α 感受态细胞，筛选后抽提质粒，进行双酶切和测序鉴定。

取鉴定正确的pLVTHM-GFP/ERβ-shRNA 重组质粒 20 μg，与pRsv-REV 10 μg、pMDlg-pRRE 15 μg、pMD2G 7.5 μg 混合后转染 hMG63 细胞，实验分为空白载体组、空白对照组和ERβ-siRNA组，转染 48 h 后在倒置荧光显微镜下观察各组细胞的转染效果，并采用流式细胞术检测 ERβshRNA 转染 hMG63 细胞的转染效率。

1.2.3 目的基因干扰效率的检测 按 Trizol Reagent 说明书的步骤，抽提各组细胞的Total RNA，利用第一链 cDNA 合成试剂盒（ReverTra Ace-α First Strand cDNA Synthesis Kit）经 RT-PCR生成相应的cDNA。以各组cDNA 作为模板，根据 Realtime-PCR 试剂盒说明书，利用两步法进行Realtime-PCR，目标片段扩增引物 ERβPf和ERβPr的序列分别为（位于242～392 bp）：5’ CAACACCT GGGCACCTTT 3’和5’ TTCCCACTAACCTTCCT TTT 3’，退火温度为59 ℃，延伸循环数为45。

根据相对定量法计算目标片段的扩增比例，mRNA的相对变化量公式为：Ratio=2-△△Ct，并绘制标准曲线，扩增产物以 2%的琼脂糖凝胶电泳进行观察。以 18S RNA 作为内参，各样本重复 3 次。

1.3 统计学处理

应用 SPSS11.0 统计学软件进行数据处理，各组目的基因干扰效率的比较采用方差分析，以 P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ERβ-shRNA 转染 hMG63的效果

pLVTHM-GFP/ERβ-shRNA 重组质粒转染hMG63 细胞 48 h 后，倒置荧光显微镜下观察细胞转染效果，ERβ-siRNA组hMG63 细胞 90% 以上呈现绿色荧光（GFP），而空白对照组和空白载体组细胞基本无荧光（图 1）。流式细胞术检测结果表明，ERβ-shRNA 转染 hMG63 细胞的转染效率为92.3%（图 2）。

图1 ERβ-shRNA 转染 hMG63 细胞 48 h 后的转染效果 倒置荧光显微镜×100（A：空白对照组；B：空白载体组；C：ERβ-siRNA组）Figure1 The transfection effect of hMG63 cells transfected with ERβ-shRNA after 48 hours (Inverted fluorescence microscope×100).A: Control group; B: Blank vector group; C: ERβ-siRNA group.

图2 ERβ-shRNA 转染 hMG63 细胞效率的流式细胞术检测Figure2 The transfection efficiency of hMG63 cells transfected with ERβ-shRNA by flow cytometry

2.2 ERβ 沉寂表达的效果

ERβ 表达量表达差异倍数用 1.993ˇ－△△Ct表示，结果表明，ERβ-siRNA组ERβ 表达量（0.17±0.01）仅约为空白载体组（1.00±0.01）的17.3%（P＜0.001）；ERβ-siRNA 对 hMG63 细胞ERβ 基因的抑制效率约为83%（图3）。

图3 ERβ-shRNA 转染 hMG63 细胞后ERβ的沉寂表达效果（a P＜0.001）Figure3 The silence expression effect of hMG63 cells transfected with ERβ-shRNA.aP＜0.001.

3 讨论

RNAi 技术通过双链 RNA 引发转录后沉默，产生 RNAi 现象[4]。该技术具有高度的序列专一性，可使特定基因不表达或低表达，比反义RNA技术和同源共抑制更有效，更容易产生功能丧失或降低突变，目前已经成功地对上百种哺乳动物细胞目的基因进行功能分析，从而成为一种抑制体细胞功能基因翻译表达的有效手段[5]。选择性地抑制成骨细胞优势表达的ERβ亚型，可有效地分析是否该亚型介导了 DHEA 对成骨细胞的增殖和抗凋亡作用及其具体的信号转导机制。

2 种ER亚型独特的转录激活区域，以及不同的组织分布，是靶组织对配体反应的重要决定因素。ER的配体不只是雌激素，还可与DHEA等雄激素结合。虽然 DHEA 与ER的结合力较雌激素与ER的结合力低数个能量级，但体外实验证实，在经典 ER 存在时，DHEA 可直接激活雌激素应答元件（ERE），而不依赖其向雌二醇（E2）转化[6]。综合 DHEA 抑制破骨的作用，有学者认为DHEA 可能直接作用于成骨细胞的ERβ，通过促进 OPG的表达，从而抑制破骨细胞的噬骨作用[7]。

在本研究中，我们利用慢病毒载体（pLVTHM）介导 ERβ-siRNA 转染成骨细胞 hMG63，结果显示其转染效率为92.3%；ERβ-siRNA 抑制 ERβ 表达的效率为83% 左右，充分满足了在ERβ 缺失或低表达时，研究成骨细胞功能的需要。

综上，本研究成功建立了 ERβ 沉寂表达的成骨细胞模型，满足了研究成骨细胞中 ERβ 相关功能的需要，为了解 ERβ 介导 DHEA 防治绝经后骨质疏松的作用机制提供了平台。

[1]Wang YD, Li DJ.The family of estrogen receptor and related co-factors.Foreign Med Sci Section Endocr, 2004, 24 Suppl:57-59.(in Chinese)王玉东, 李大金.雌激素受体家族及其相关的辅助因子.国外医学.内分泌学分册, 2004, 24(增刊):57-59.

[2]Wang YD, Tong JQ, Luo LM, et al.Up-regulation of ERbeta in murine osteoblasts with the action of dehydroepiandrosterone.Chin Pharm J, 2006, 41(7):509-512.(in Chinese)王玉东, 童剑倩, 罗来敏,等.脱氢表雄酮对成骨细胞ERbeta的上调节作用.中国药学杂志, 2006, 41(7):509-512.

[3]Paech K, Webb P, Kuiper GG, et al.Differential ligand activation of estrogen receptors ERalpha and ERbeta at AP1 sites.Science, 1997,277(5331):1508-1510.

[4]Zamore PD, Tuschl T, Sharp PA, et al.RNAi: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals.Cell, 2000, 101(1):25-33.

[5]Morita T, Yoshida K.RNAi provides a new tool for functional analyses of the mammalian genes.Tanpakushitsu Kakusan Koso, 2002,47(14):1839-1845.

[6]Kousteni S, Bellido T, Plotkin LI, et al.Nongenotropic,sex-non-specific signaling through the estrogen or androgen receptors:dissociation from transcriptional activity.Cell, 2001, 104(5):719-730.

[7]Wang YD, Wang L, Li DJ, et al.Dehydroepiandrosterone inhibited the bone resorption through the upregulation of OPG/RANKL.Cell Mol Immunol, 2006, 3(1):41-45.