丹参酮B钠盐对局灶性脑缺血/再灌注损伤大鼠海马神经递质含量的影响*

蔡 青 ，张伯礼 ，黄淑芸 ，汪 涛 ，谭俊珍 ，周 涛 ，李春深

（1.天津中医药大学中医学院，天津 300193；2.天津中医药大学，天津 300193）

谷氨酸（Glu）和 γ-氨基丁酸（GABA）是脑内重要的神经递质，在突触传递中起着重要的角色。已有研究发现，脑缺血再灌注损伤可导致大鼠脑内Glu/GABA比例失衡[1]。本研究通过建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型，观察丹参酮B钠盐对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠海马内Glu和GABA等神经递质浓度的变化。

1 材料与方法

1.1 动物分组及模型制作

1.1.1 动物的分组及给药方式 Wistar雄性大鼠体质量280～350 g，天津中医药大学动物实验中心提供，随机分为5组，每组6只，分别为：伪手术组（Sham）、模型组（I/R）、丹参酮B钠盐（西安博胜生物科技有限公司）低剂量组（I/R+DT1，4 mg/kg）、中剂量组（I/R+DT2，8 mg/kg）、高剂量组（I/R+DT3，16 mg/kg）。各组于手术前3 d每天腹腔注射给药1次，连续3 d，末次给药30 min后，制备大鼠大脑中动脉闭塞再灌注模型（MCAO）后连续给药两次，其中伪手术组和模型组每天静脉注射等体积生理盐水。采用Zea-Long法[2]制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，假手术组除不进线外,其余过程同缺血组。再灌注组在缺血2 h后轻轻抽出鱼线,使之退出到颈总动脉剪口处即可。手术过程中大鼠体温维持在（37±0.5）℃，再灌注24 h后取材。

1.2 溶液配制

1.2.1 衍生化试剂 称取100 mg邻苯二甲醛（OPA）置于2 mL甲醇中，充分溶解后加入β-巯基乙醇 60 μL，再加 0.4 mol/L 硼酸缓冲液（pH 9.5）至10 mL，避光 4℃冷藏备用。每次过夜加 20 μL，β-巯基乙醇，可用7 d。

1.2.2 氨基酸标准品的配制 准确称量氨基酸标准品（美国Sigma公司），用50%的甲醇水定容至10 mL棕色瓶中作为贮备液。为1 g/L，4℃贮存。

1.2.3 梯度洗脱液的配制 A相：0.03 mol/L乙酸钠溶液，B 相：甲醇/0.1 mol/L 乙酸钠溶液（4∶1），0.45 μm微孔滤膜过滤，超声脱气备用。

1.3 取材、样品制备 各组大鼠，用20%氨基甲酸乙酯（1～2 g/kg）腹腔麻醉后，快速断头，低温条件下，剥离双侧海马，收集于1.5 mL离心管内并标记，置-80℃冰箱保存备用。取海马约50 mg，加200 μL无水乙醇在冰台上磨成匀浆，吸出200 μL匀浆液，在15700 r/min、4 ℃条件下离心 20 min，取 80 μL 上清液测定氨基酸含量。

1.4 衍生化反应 吸取40 μL氨基酸标准液或脑组织上清液，加入20 μL衍生化试剂，反应1 min后立即进样，进样量为25 μL。

1.5 色谱条件 色谱柱：大连依利特Hypersil ODS C18（4.6×200 mm，5 μm）；流动相：A 为 0.03 mol/L 的醋酸钠缓冲液（pH＝7.2），B 相：甲醇/0.1mol/L 乙酸钠溶液，梯度洗脱程序见表1。流速：1 mL/min，检测波长：335 nm；柱温：35℃。取25 μL进样分析，采用外标法定量。将衍生好的样品用微量进样器加入高效液相色谱仪（HP1100，Agilent，USA），并用高效液相色谱工作站LCsolution记录数据。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 The gradient of mobile phase%

1.6 标准曲线 将氨基酸标准品倍比稀释为1～8号工作液，依次进样，用高效液相色谱仪检测。在上述色谱条件下，两种氨基酸得到有效分离，保留时间分别为：Glu（9.093 min），GABA（21.245 min），图1为标准品1-4号工作液所得色谱图，保留时间基本一致，重现性良好。两种氨基酸在0.017～5 μg/L范围内线性关系良好，与峰面积呈良好的线性关系，相关系数Glu为0.99987，GABA为r=0.9993，得出回归方程如下：GLU：f=-39.8113+21132.7545x，GABA：f=-53.8116+8691.631 0x。

1.7 样品测定 经衍生化反应的各组样品按1.5色谱条件进行检测，用已知的各标准品氨基酸色谱峰保留时间与脑组织匀浆上清液的色谱峰保留时间对照定性，并精密度实验和回收率实验（结果未显示）。

1.8 统计学分析 记录到的数据，用HP1100高效液相色谱工作站LCsolution分析后，分别得到Glu和GABA的峰面积，将峰面积分别带入回归方程，可得到Glu和GABA的相对浓度。定量方法：用外标法将三种氨基酸标准品的色谱峰面积值按以下公式进行换算：C=R1/R2×D ×N，式中：R1=待测样品的峰面积；R2=氨基酸标准样品峰面积；D=氨基酸标准样品的浓度（g/L）；N=稀释倍数；C=待测样品浓度（g/L），最终计算海马组织中两种氨基酸的含量。所得到的数据采用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析结果用均数±标准差（±s）表示，显著性水平为 P＜0.05。

2 结果

2.1 丹参酮B钠盐脑缺血再灌注大鼠海马谷氨酸含量的影响 图2为典型的海马组织匀浆高效液相图片，各组谷氨酸含量如表所示（表2）。假手术组（Sham）谷氨酸含量显著低于其他各组（P<0.01）。脑缺血对照组（I/R）谷氨酸含量显著高于丹参酮B钠盐各组（P<0.01）。丹参酮B钠盐高剂量组（I/R+T3）谷氨酸含量显著低于丹参酮B钠盐低剂量组（I/R+T1）、中剂量组（I/R+T2）（P<0.01）。

2.2 丹参酮B钠盐脑缺血再灌注大鼠海马GABA含量的影响 图2为典型的海马组织匀浆高效液相图片，各组GABA含量如表3所示。假手术组（Sham）GABA含量显著低于脑缺血对照组（I/R）、丹参酮 B钠盐低剂量组（I/R+T1）和中剂量组（I/R+T2）（P<0.01）。丹参酮B钠盐高剂量组（I/R+T3）GABA含量显著低于脑缺血对照组（I/R）、丹参酮B钠盐低剂量组（I/R+T1）和中剂量组（I/R+T2）（P<0.01）。丹参酮 B 钠盐低剂量组（I/R+T1）、中剂量组（I/R+T2）GABA含量低于脑缺血对照组（I/R），但无显著差异。

表2 不同组大鼠海马组织谷氨酸含量Tab.2 Glutamate content in rat hippocampus of different groups(n=6)mg/g

表3 不同组大鼠海马组织GABA含量Tabl.3 GABA content in rat hippocampus of different groups mg/g

3 讨论

近年来的研究表明，中枢高浓度的Glu水平会导致神经细胞的死亡。本研究结果发现，脑缺血/再灌注可以导致海马的Glu浓度上升，细胞外的Glu富集，可能通过改变突触后NMDA受体的活性上调，引起大量Ca2+内流引起急性的渗透性损伤和慢性的氧化损伤，而导致海马神经细胞的丢失，海马的形态学损伤。因此，脑缺血/再灌注引起的海马内Glu浓度的升高，这可能造成海马神经细胞的兴奋性毒性损伤，也可能是海马损伤的基础，是海马依赖的学习记忆能力下降的神经内分泌学基础。

兴奋性氨基酸与抑制性氨基酸的失衡，对激发兴奋毒性起一定作用，是脑组织缺血后再灌注过程的主要分子机制之一。在脑组织中，GABA与Glu是一对重要的抑制与兴奋性神经递质，两者的平衡对维持脑功能至关重要。GABA含量的增加对兴奋性和抑制性传递的平衡起着关键作用，可能通过突触后膜超极化，减少钙内流，降低细胞代谢使突触后神经元处于保护性抑制状态，并通过突触前抑制减少兴奋性氨基酸递质释放，减少低灌注区神经元细胞死亡，进而间接导致对缺血性脑损伤的发生发展产生特殊影响，从而对抗兴奋性氨基酸的毒性作用[8]。研究发现，Glu/GABA比值的变化可在一定程度上反应脑内氨基酸递质的平衡情况，并影响到神经生理功能的变化[9]。脑缺血/再灌注引起的谷氨酸含量的升高，同时导致的海马GABA含量的升高，可能是机体对脑缺血/再灌注损伤的一种保护反映。脑缺血时GABA脑内释放量升高，在脑缺血早期对Glu释放增多引起的兴奋性毒性有一定的保护作用，但GABA受体的缺血耐受性低于Glu受体，脑缺血到一定程度时，脑内释放的GABA并不能对抗脑缺血时Glu引起的神经功能损害。

本研究发现，脑缺血/再灌注可使海马内谷氨酸、GABA浓度的明显升高而丹参酮B钠盐具有明显对抗作用，脑缺血/再灌注海马神经元细胞外液谷氨酸含量，可能会影响谷氨酸能神经元和GABA能神经元分布的相应改变，从而可能影响海马内兴奋的传递。

[1]Xu XH,Zheng XX,Zhou Q,et al.Inhibition of excitatory amino acid efflux contributes to protective effects of puerarin against cerebral ischemia in rats[J].Biomed Environ Sci,2007,20(4):336-342.

[2]Zea Longa EL,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without cranectomy in rat[J].Stroke,1989,20(1):84-91.