化浊通脉散对ASO家兔VEGF表达及血脂变化影响的研究*

李慎贤

（中国医科大学附属盛京医院中医科，沈阳 110004）

下肢动脉硬化闭塞症（ASO），动脉粥样硬化（AS）发病率居高不下。血清低密度脂蛋白的升高，对血管内皮细胞产生严重损伤，因此降脂治疗可减少动脉血管内皮损害，抑制AS的进展，从而消除ASO的发病基础[1-2]。本实验通过高脂饮食喂养家兔及股动脉血管内膜造成机械性损伤，模拟ASO形成过程以化浊通脉散干预，检测实验前后家兔的血脂变化及观察局部血管斑块血管内皮生长因子（VEGF）的表达，探讨该方治疗ASO的机制，为明确中药作用靶点及新药开发奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料 新西兰大耳白兔40只，4月龄，体质量2.5～2.8 kg，由中国医科大学附属盛京医院动物实验中心提供，许可证号：SCXK（辽）2003－0013。化浊通脉散组成:黄芪50 g，赤芍20 g，川芎20 g，当归20 g，地龙 20 g，红花 10 g，川牛膝 10 g，水蛭 10 g，泽泻10 g，焦山楂20 g，由三九药业集团提供，批号：0807021。阿司匹林：由沈阳奥华制药有限公司生产，批号：080606。胆固醇：由国药集团化学试剂沈阳有限公司提供，批号：F20071220。牛血清白蛋白注射液：由北京奥博星生物技术有限责任公司生产，批号：20080815。

1.1.1 实验试剂与仪器 免疫组化试剂盒：VEGF、生物素化羊抗兔IgG、链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（SABC）由武汉博士德生物工程有限公司提供，批号：20090214。主要仪器：德国eppendorf 5417R离心机，雅培ARCHITECT ci8200全自动生化免疫分析仪，Olympus Bx-41型光学显微镜，德国Ldilacom-1900型石蜡切片机。

1.2 实验方法

1.2.1 造模与分组 实验前适应性喂养1周，排除饮食异常者。1周后随机分为4组，每组10只：即化浊通脉散组（A），阿司匹林组（B），模型组（C），假手术组（D），分笼饲养。D组喂养普通饲料，自由饮水，其余3组自实验开始喂高脂饮食（正常饲料中加胆固醇1 g，猪油5 g），共喂养12周。其中实验开始第3天对全部家兔以10%水合氯醛5 mL/kg腹腔麻醉，行左侧股动脉插管，在大腿近端沿左股动脉走行处，钝性分离出股动脉约2 cm，动脉壁上剪一小口后插入球囊至大腿近端处，球囊反复牵拉8次，以确保内膜损伤，退出导管，庆大霉素稀释液冲洗伤口。逐层缝合皮下组织和皮肤。术后肌肉注射庆大霉素8万U 1次预防感染。手术后第4天A、B、C组静脉注射牛血清白蛋白250 mg/kg；D组注射等量的生理盐水。第13周各组均为普通饲料喂养，且A组予化浊通脉散7.2 g/（kg·d）混入饲料（药物均根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”计算[3]），B组给予肠溶阿司匹林12.6 mg/（kg·d）混入饲料中，C、D两组均未加任何药物，在以上条件下共喂养3周。

1.2.2 各实验指标测定及方法 造模前与实验结束时分别取兔耳缘静脉取外周静脉血2 mL，均以2500 r/min离心30 min，取得血清，应用雅培全自动生化免疫分析仪分别检测甘油三酯（TG）、胆固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）等，比较各组数值造模前后的变化及各组之间的变化。

1.2.3 取材及局部血管内皮生长因子（VEGF）免疫组化 实验结束取血后，应用麻醉法处死全部动物，切取左髂股动脉2～3 cm，留取1～2 cm纵行切开，肉眼观察血管内膜斑块形态。利用免疫组化法观察：1）用多聚赖氨酸（Poly－Lysine）少许涂载玻片待凉干备用。2）切片常规脱蜡至水。3）3%双氧水（H2O2）室温孵育8min，蒸馏水洗3次。4）将切片浸入0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液，微波炉加热至沸腾后断电，间隔10 min后，反复2次；冷却后磷酸盐缓冲生理盐水（PBS），pH 7.2～7.6洗涤2次。5）滴加5%正常山羊血清（BSA）封闭液，室温20 min，甩去多余液体，不洗。6）滴加适当稀释的一抗1∶150兔抗VEGF，4℃过夜，PBS洗5 min×3次。7）滴加二抗：生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃ 20 min。PBS洗 2 min，3次。8）滴加试剂SABC，37℃20min。PBS洗5min×4次。9）取1mL蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各1滴，混匀后加至切片，镜下控制反应时间，一般在5～30 min之间，蒸馏水洗涤终止反应时间。10）脱水，中性树胶封片，备光镜下观察。

1.3 统计学处理 用SPSS 12.0统计软件进行统计学处理，所有实验数据以均数±标准差（±s）表示，正态分布资料采用单因素方差分析，偏态分布资料采用秩和检验，P<0.05表示有差异，P<0.01表示有显著性差异。

2 结果

2.1 股动脉粥样硬化斑块的形态特点 肉眼可见，股动拖拉处管壁明显增厚，有较大的斑块形成，管腔狭窄。光镜下可以看到，斑块中有大量泡沫细胞堆积，一些血管内皮细胞长入斑块周围，伴有平滑肌细胞和胶原组织增生。

2.2 免疫组化结果正常兔血管壁无VEGF表达[4]，结果显示：A组（图1A）与C组（图1C）相比：斑块区表达的阳性率明显降低（P＜0.01），B 组与 C 组，斑块区阳性率无明显差异（P＞0.05），A 组（图 1A）与 D 组（图 1D）相比，表达的阳性率略有升高（P＜0.01），因此，A组的表达阳性率明显低于B组及C组，见表1。

表1 髂股动脉血管内皮生长因子表达的免疫组化分析(±sTab.1 Immunohistochemistry analysis of the expression of VEGF in the arteria iliacofemoralis(±s%

表1 髂股动脉血管内皮生长因子表达的免疫组化分析(±sTab.1 Immunohistochemistry analysis of the expression of VEGF in the arteria iliacofemoralis(±s%

n组别A组B组C组D组10101010 VEGF阳性率33.165±1.01750.321±1.28150.209±2.07724.936±1.735

2.3 血脂系列检查结果造模前各组血脂指标比较无显著差异（P＞0.05）。实验结束后，A 组与 B 组、C组相比较：TC、TG、LDL－C 均较低（P＜0.01），有显著性差异，而 HDL－C（P＞0.05），无显著性差异。B 组与C 组相比较：TC、TG、HDL－C 无显著性差异 （P＞0.05），但 LDL－C 低于 C 组（P＜0.01）。A 组与 D 组相比，通脉化浊散组TC、TG、LDL－C明显低于D组（P＜0.01），而 HDL－C（P＞0.05）未见明显差异。见表2

3 讨论

有研究认为降脂疗法可以有效的治疗AS，实验结果表明本方能明显降低TC、TG、LDL-C等指标，尤以降LDL-C最为突出。提示本方具有调节血脂、改善血脂代谢的作用，可能是通过降低TC、LDL-C来抑制VLDL-C的氧化修饰，减少炎症因子导致的血管损伤，因此，有利于发挥稳定粥样斑块的效果。

另外，本实验通过使用化浊通脉散对模型家兔动脉硬化斑块VEGF进行干预，实验数据证实化浊通脉散组与模型组相比，斑块染色呈弱阳性表达，模型组、阿司匹林组与化浊通脉散组相比斑块染色均呈强阳性表达，化浊通脉散组的VEGF染色阳性面积明显减少，提示本方可减少斑块血管新生的作用，且与减少VEGF表达有关，所以化浊通脉散可有抑制斑块内血管新生，抑制斑块生长等作用。因此，化浊通脉散可针对ASO病理基础展开治疗，抑制VEGF表达，降低血脂减少内皮细胞损伤，因而具有治疗ASO的作用。

表2 各组动物血脂指标比较(±sTab.2 Comparison of blood lipid indexes in

表2 各组动物血脂指标比较(±sTab.2 Comparison of blood lipid indexes in

注：A组与B组、C组，有显著性差异，*P＜0.01；A组与B组、C组，有显著性差异，△P＜0.01；A 组与 D 组，有显著性差异，●P＜0.01。

mmol/L组别A组various groups(±sB组C组D组治疗前治疗后治疗前治疗后治疗前治疗后治疗前治疗后TC 1.96±0.7316.02±2.23*△#1.98±0.7019.98±1.242.00±0.1621.19±1.391.99±0.957.71±1.52*TG 1.58±0.607.52±1.17*△#1.55±0.7310.40±0.651.56±0.5110.71±0.651.55±0.533.72±1.26*HDL 0.62±0.510.63±0.290.63±0.100.62±0.110.61±0.640.61±0.310.60±0.480.64±0.34 LDL 0.61±0.506.21±1.09*△#0.61±0.187.70±0.61△0.61±0.6711.47±0.890.59±0.511.03±0.33*

传统中医认为ASO属中医“脉痹”、“脱疽”、“血癖”等范畴，其形成机制与寒凝血瘀相关，治疗多以温经散寒，活血通脉为主，代表方剂如：阳和汤、四妙勇安汤，实际应用体会疗效并不十分理想。现代中医认为本病多因饮食失节，多食膏粱厚味，而损伤脾胃，造成脏腑亏虚、湿浊内生，导致痰瘀互结阻塞经脉。因此，遵循“治病务求其本”的原则本方遵循此病机采用“行气活血、化痰通脉”的治疗原则配置而成。本方重用黄芪益气，推动气血运行，并激发脏腑功能活动，以助痰湿运化；当归重在养血活血祛瘀通脉；两药合用可宣通气血共为君药。地龙、水蛭、红花、赤芍活血散瘀通经，现代医学研究具有抗凝作用，防止血栓形成；泽泻、焦山楂泄湿化浊，有降血脂作用，两组共为臣药。牛膝引药下行直通下肢，兼以活血，为佐使药；全方共凑益气活血、化浊通脉之功效。上述实验也以证明本方对ASO形成的不同环节起到了干预作用[5]。

[1]Danlel Steinberg.Atherogenesis in perspective:Hypercholesterolemia and inflammation as partners in crime[J].NatMed,2002,8(11):249-259.

[2]Haug C,Lenz C,Diaz F.Oxidized low-density lipoproteins stimulate Extrace llular matrixmetalloproteinase inducer(EMMPRIN)release by coronary smooth muscle cells[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2004,24:1823-1829.

[3]徐淑云，卞如濂，陈 修.药理实验方法学[M].北京：人民卫生出版，2002：202-203.

[4]InoueM,ItohH,Ueda M,et al.Vascular endothelial growth factor(VEGF)expressin in human coronary atherosclerosis lesions possible pathophysiologicalsignificance of VEGF in progression of atherosclerosis[J].Circulation,1998,98(20):108-116.

[5]李慎贤，胡 莹.化浊通脉散加疏血通治疗早期动脉硬化闭塞症 80 例疗效观察[J].2005；28（3）：39-41.