基于炮效关系研究白芥子镇咳药效物质基础

冯宝民，邱 琳，谌启鹏，王惠国，史丽颖，蒋 革，唐 玲，王永奇，苑艳霞

中药炮制是体现中医用药特点的主要内容之一，直接关系到临床用药的疗效。有些药物必须进行炮制，有效成分才能溶出，有些药物经炮制后，有效成分的溶出率明显增加，因此，中药的功效与其炮制方法有着极为密切的联系。

白芥子为为十字花科(Cruciferae)芥属植物白芥Sinapis alba L.的种子，辛，温，归肺经，临床入药常以炒黄法炮制［1］。现代药理学研究表明:炒白芥子的镇咳作用优于生白芥子［2-3］，提示炒制法可以提高白芥子镇咳药效成分的溶出率。为明确白芥子镇咳的药效物质基础，本研究前期从炒白芥子中分离得到了10个化合物，分别鉴定为4-羟基苯乙酸-2′-醛基-5′-呋喃甲酯(Ⅰ)、对羟苯基乙腈(Ⅱ)、对羟基苯甲醛(Ⅲ)、胡萝卜苷(Ⅳ)、软脂酸-1-单甘油酯(Ⅴ)、β-谷甾醇(Ⅵ)、芥子酸(Ⅶ)、对羟基苯甲酸(Ⅷ)、对羟基苯乙酸(Ⅸ)和双(5-甲酰基糠基)醚(Ⅹ)［4］。HPLC 研究结果显示，上述成分中，对羟基苯乙腈含量在炒制后明显增加。对羟基苯乙腈的氰基结构可能在体内经过Ⅰ相酶系的作用产生氰化氢(HCN)，从而起到中枢镇咳作用［5］，因此，本研究拟分离纯化对羟基苯乙腈并对其镇咳作用进行研究，为白芥子炮制机制及白芥子镇咳活性成分的研究提供实验依据。

1 仪器与材料

XT4A显微熔点测定仪，JEOL JNM-AL400型、Bruker ARX-500型核磁共振仪，JEOL JMS-700型质谱仪，Waters 515高效液相色谱仪，Waters 2487 Dual λ紫外检测器，Chromstation数据处理系统，BP210s 1/1万电子天平(Sartorius公司)，BP211s 1/10万电子天平(Sartorius公司)，Laborato 4000型旋转蒸发仪(Heidolph公司)，秒表(深圳追日电子公司)。

白芥子购自河北安国，经大连大学医学院高松副教授鉴定为十字花科植物白芥Sinapis alba L.的干燥成熟种子。氨水(安徽宿州化学试剂厂)，10～40 μm薄层色谱用硅胶、200～300目柱色谱用硅胶(青岛海洋化工厂)。

昆明种小白鼠，♀♂各半，体质量(20±2)g，购自大连医科大学实验动物中心。

2 方法

2.1 炒制前后白芥子中对羟基苯乙腈含量的比较

炒白芥子的制备:取净白芥子，分别用文火加热5、10 min，炒至表面呈黄色，有爆裂声，并放出香辣气味，取出，放凉。

色谱柱条件:色谱柱为Luna 5u Pheny1-Hexy1(250 mm ×4.60 mm，5 μm);流动相为甲醇 -水(35∶65，V/V)流速0.6 ml·min-1;检测波长287 nm。

标准曲线的绘制:精密称取对羟基苯乙腈对照品加甲醇溶解并定容至质量浓度分别为10、20、30、40、50 mg·L-1的溶液。精密吸取各溶液 10 μl，注入液相色谱仪，测得进样浓度(X)对峰面积(Y)的直线回归方程。

供试品溶液的制备:取生白芥子与5 min炒白芥子、10 min炒白芥子，各20 g，粉碎，石油醚脱脂，过滤，药渣用0.95乙醇回流提取3次，合并提取液;浓缩至无醇味，得其浸膏，分别精密称取样品的浸膏0.1 g，加甲醇溶解并定容至50 ml，得浓度为2 g·L-1的溶液，备用。

样品测定:分别精密吸取各供试品溶液10 μl，注入液相色谱仪，按上述条件测定，根据标准曲线的回归方程求出含量。

2.2 实验动物的筛选及引咳实验 动物筛选:将小鼠放入倒置的烧杯内，迅速放入注有1.0 ml浓氨水的棉球，5 s后立即取出，2 min内不咳嗽者舍去。

引咳实验:在筛选实验结束7 d后，随机分组，给药结束后，将小鼠放在倒置的600 ml的烧杯内，迅速放入注有1.0 ml浓氨水的棉球，一熏一换氨水球，每次熏1只小鼠。记录放入时间，观察并记录咳嗽潜伏期，并记录2 min内小鼠的咳嗽次数。

2.3 白芥子炒制前后镇咳作用比较 实验动物灌胃给药。分组及给药剂量如下:A阴性对照组(蒸馏水0.5 ml·d-1)、B生白芥子组(含4.500 g·kg-1·d-1生白芥子生药醇提液)、C炒白芥子组(含4.500 g·kg-1·d-1炒白芥子生药的醇提液)。各组小鼠连续灌胃给药7 d，在d 7给药30 min后，参照“2.2”进行引咳实验。

2.4 对羟基苯乙腈的制备 取炒白芥子5.0 kg，粉碎，用石油醚(60℃ ～90℃)室温冷浸脱脂3次(每次24 h)，晾干，以0.95乙醇回流提取，合并提取液，减压回收乙醇至无醇味，得浸膏733 g;该浸膏加入7 L蒸馏水溶解分散后，依次用1/3体积的醋酸乙酯萃取4次，回收溶剂，得醋酸乙酯萃取物200 g，经多次柱色谱分离及重结晶得到对羟基苯乙腈化合物。

2.5 对羟基苯乙腈镇咳作用研究 实验动物灌胃给药。分组及给药剂量如Tab 3:A炒白芥子组(含4.500 g·kg-1·d-1炒白芥子生药的醇提液，其中含对羟基苯乙腈0.022 5 g·kg-1·d-1)，B对羟基苯乙腈低剂量组，C对羟基苯乙腈中剂量组，D对羟基苯乙腈高剂量组。在d 7给药30 min后，参照“2.2”进行引咳实验。

2.6 统计学处理 所得数据用SPSS 10.0软件处理，首先进行正态分布及方差齐性检验，统计结果表明，数据符合正态分布，但方差不齐，故采用近似t检验，即 t′检验。

3 结果

3.1 炒制前后白芥子中对羟基苯乙腈含量的变化

进样浓度(X)对峰面积(Y)的直线回归方程为^Y=5.841×103X+3.573×103，r=0.999 6;线性范围0.5～2.5 mg。由Tab 1可见白芥子中对羟基苯乙腈含量随着炒制时间的延长而增加。白芥子炒制5 min后，其中对羟基苯乙腈的含量是生白芥子的5.5倍，白芥子炒制10 min后其中对羟基苯乙腈的含量是生白芥子的7.5倍。

Tab 1 Comparison of p-hydroxyphenylacetonitrile content between fresh and roasted sinapis alba seeds

3.2 炒白芥子与生白芥子镇咳作用比较 如Tab 2所示，与阴性对照组相比，生白芥子能够延长实验动物的咳嗽潜伏期，但抑制实验动物2 min内咳嗽次数作用不明显;炒白芥子具有明确的镇咳作用。与生白芥子相比，相同剂量情况下，炒白芥子延长实验动物咳嗽潜伏期、抑制实验动物2 min内咳嗽次数的效果均优于生白芥子，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

Tab 2 Comparision of antitussive action between fresh and roasted sinapis alba seeds±s，n=20)

Tab 2 Comparision of antitussive action between fresh and roasted sinapis alba seeds±s，n=20)

*P＜0.05 vs negative control group;#P＜0.05 vs fresh seeds of sinapis alba group

Group Dose/g·kg-1·d-1 Cough latent period/s Cough times in 2min A Negative - 6.229±2.274 27.357±9.312 B Fresh sinapis alba seeds 4.500 14.243±3.471* 23.125±8.413 C Roasted sinapis alba seeds 4.500 25.774±6.903*#15.800±3.942*#

3.3 对羟基苯乙腈的制备 200 g醋酸乙酯萃取物经多次柱色谱分离及重结晶得到无色棱柱状结晶，mp 66℃ ～ 67℃ (氯仿)。EI-MS m/z:133［M+］，132，106，105，78，77，51，50，39。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ:7.15(2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，6′)，6.83(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，5′)，5.87(1H，brs，-OH)，3.62(2H，s，H-2)。13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δ:155.4(C-4′)，129.1(C-2′，6′)，121.3(C-1′)，118.2(-CN)，115.9(C-3′，5′)，22.9(C-2)。以上数据经与文献［6］及 Sadtler光谱［7］中对羟基苯乙腈对照基本一致，故鉴定其为对羟基苯乙腈。

3.4 对羟基苯乙腈镇咳作用研究 由Tab 3可知，与阴性对照A组相比，对羟基苯乙腈具有明确的镇咳作用，差异具有统计学意义(P＜0.05)。与B炒白芥子组相比，对羟基苯乙腈的低剂量组与炒白芥子镇咳效果相当，对羟基苯乙腈的中剂量组，其抑制实验动物2 min内咳嗽次数效果优于炒白芥子，对羟基苯乙腈的高剂量组，其延长实验动物引喘潜伏期、抑制实验动物2 min内咳嗽次数作用均优于炒白芥子。

Tab 3 The antitussive effect of p-hydroxyphenylacetonitrile(n=6)

4 讨论

中药炮制工艺是中医临床用药的一大特色。中药在炮制过程中发生了某些成分的变化，因而导致其药理活性的变化。研究中药材的炮效关系对于分析中药药效物质基础具有一定的指导意义。

白芥子临床入药以炒制法为主，本研究结果显示，炒白芥子镇咳活性明显优于生白芥子，这说明炒制法可以提高白芥子中镇咳药效成分含量。我们对炒白芥子和生白芥子的化学成分进行对比分析，结果显示，炒制后对羟基苯乙腈含量明显增加，白芥子炒制10 min后，其中对羟基苯乙腈含量是炒制前的7.5倍。依据炮效关系进行分析，对羟基苯乙腈很可能是白芥子镇咳的药效成分，本研究在此基础上，分离纯化出对羟基苯乙腈并对其镇咳作用进行考察，结果发现，对羟基苯乙腈具有明确的镇咳作用，其延长实验动物咳嗽潜伏期、抑制实验动物2 min内咳嗽次数效果明显优于空白对照组，可以确定对羟基苯乙腈为白芥子镇咳药效成分。对羟基苯乙腈在延长实验动物咳嗽潜伏期方面具有一定的量效关系，中剂量的对羟基苯乙腈抑制实验动物2 min内咳嗽次数作用效果优于炒白芥子。高剂量的对羟基苯乙腈镇咳效果尤为明显，其延长实验动物咳嗽潜伏期、抑制2 min内咳嗽次数效果均优于炒白芥子，组间差异有显著性(P＜0.05)。

［1］国家药典委员会.中国药典Ⅰ部［S］.北京:化学工业出版社，2005:110.

［1］China Pharmacopoeia Committee.Chinese Pharmacopeiachp PartⅠ［S］.Beijing:Chemical Industry Publisher，2005:110.

［2］张学梅，刘凡亮，梁文波，等.白芥子提取物的镇咳、祛痰及平喘作用研究［J］.中草药，2003，34(7):635-7.

［2］Zhang X M，Liu F L，Liang W B，et al.Antitussive，expectorant and antiasthmatic effects of Brassica alba extracts［J］.Chin Tradit Herb Drugs，2003，34(7):635-7.

［3］江苏新医学院.中药大辞典［M］.上海:上海人民出版社，1977:716.

［3］Jiangsu New Medical College.Dictionary of Traditional Chinese Medicine［M］.Shanghai:Shanghai People Press，1977:716.

［4］冯宝民，余正江，段礼新，等.炒白芥子中化学成分的研究［J］.天津:中草药，2008，39(3):331-3.

［4］Feng B M，Yu Z J，Duang L X，et al.Chemical constituents of roasted sinapis seeds［J］.Tianjin:Chin Tradit Herbal Drugs，2008，39(3):331-3.

［5］罗集鹏.生药学［M］.北京:中国医药科技出版社，2005:336.

［5］Luo J P.Pharmacognosy［M］.Beijing:Chinese Medicine Science and Technology Press，2005:336.

［6］吕秋军.新药药理学研究方法［M］.北京:化学工业出版社，2007:334-6.

［6］Lü Q J.Methodology of new drug research in pharmacology［M］.Beijing:Chemical Industry Publisher，2007:334-6.