氯沙坦抑制内质网特有凋亡途径在糖尿病大鼠肾脏中的保护作用

曹延萍，王 建，李 航，刘青娟，段惠军

血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)通过血流及非血流动力学因素，在糖尿病肾病发生发展过程中起重要作用，氯沙坦为血管紧张素Ⅱ受体1拮抗剂(angiotensinⅡreceptor 1 antagonosm，AT1RA)，通过阻断 AngⅡ与其受体结合，具有肾脏保护作用，研究表明［1］氯沙坦可以通过影响凋亡相关基因bax和bcl-2表达而抑制肾脏细胞凋亡。本研究观察了氯沙坦对糖尿病大鼠肾脏细胞增殖、凋亡以及内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)标志蛋白 GRP78及其特有的凋亡途径Caspase-12表达的影响，探讨这种保护作用是否部分通过抑制内质网应激特有凋亡途径实现，以期对其保护肾脏机制得以更深一步的认识。

1 材料与方法

1.1 材料 Wistar♂大鼠由河北省实验动物中心提供。链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ，Sigma公司)，小鼠抗大鼠PCNA单克隆抗体(武汉博士德生物工程公司)，兔抗GRP78单克隆抗体(NeoMarkers公司)，Caspase-12单克隆抗体(Abcam生物制品有限公司)，TUNEL试剂盒(Promega公司)，科素亚(杭州默沙东制药有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型及分组 选取体质量120～140 g♂Wistar大鼠30只，所有大鼠均用戊巴比妥钠(40 mg·kg－1)腹腔注射麻醉，行右肾切除术。2周后大鼠切口完全愈合。随机分为右肾切除对照组(A组n=10)、糖尿病组(B组n=10)和氯沙坦治疗组(C组n=10)。B组和C组大鼠腹腔单次注射STZ(65 mg·kg－1WT，用 pH 4.5，0.1 mol·L－1枸橼酸钠缓冲液配制)，A组只注射相同体积的枸橼酸钠缓冲液。48～72 h后，血糖≥16.7 mmol·L－1，尿糖～确认为糖尿病模型。C组每天用氯沙坦按40 mg·kg－1灌胃56 d，A及B组只灌等量蒸馏水。实验期间动物自由进饮食，不使用胰岛素及其他降糖药物。

1.2.2 标本收集 DM模型建成后，每周测血糖1次，不符合标准者弃去;于成模8周称重后用代谢笼收集24 h尿，乙醚麻醉，股动脉取血，分离血清，用于生化指标测定。切取左肾，去掉被膜，滤纸吸干血迹后称重，部分置于质量分数0.04多聚甲醛固定留做HE、PAS染色及免疫组化、TUNEL检测，部分置于体积分数为70的乙醇固定后行流式细胞术检测。

1.2.3 血、尿生化指标测定 Glu、Scr、Ucr、BUN、尿蛋白均用日立7170A全自动生化分析仪测定，并计算肌酐清除率(creatinine clearance，Ccr)。

1.2.4 常规病理学观察 肾组织石蜡包埋后切片2 μm，常规HE、PAS染色，光镜下观察肾组织形态学改变。

1.2.5 免疫组织化学检测 采用SP法。2 μm肾组织切片，常规脱蜡至水，一抗PCNA、GRP78(1∶100)，Caspase-12(1∶1000)稀释，二抗为生物素化山羊抗兔IgG，PBS替代一抗作为阴性对照，DAB显微镜控制下显色。

1.2.6 TUNEL法检测细胞凋亡 肾脏2 μm切片常规脱蜡入水，蛋白酶K室温下消化，TDT酶反应液37℃孵育1 h，体积分数为0.3 H2O2抑制内源性过氧化物酶，Streptavidin-HRP室温5 min，DAB显色，苏木精复染。阴性对照采用无酶标记液(删除TDT)代替TDT酶反应液。凋亡细胞核呈棕褐色颗粒，光镜下观察并计数凋亡细胞。

1.2.7 流式细胞术检测细胞凋亡水平及GRP78和Caspase-12的表达 将标本用网搓法制成单细胞悬液，采用间接免疫荧光法，在细胞悬液中分别加入1∶200稀释的兔抗 GRP78和1∶1000的兔抗Caspase-12单克隆抗体，37℃温浴30 min后洗涤，加入羊抗兔FITC-IgG，温浴洗涤后行流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司，Epics-XLⅡ型)检测，测量的数据应用相应的程序进行资料处理，测定前以标准样品调整仪器CV值在2%以内。GRP78和Cas pase-12表达的定量分析以荧光指数(FI)表示其相对含量:FI=(样品的平均荧光强度－对照样品平均荧光强度)/正常组织平均荧光强度。

2 结果

2.1 肾功能改变 8 wk时B组与A组相比，血糖、BUN和尿蛋白明显增高，Ccr明显降低(P＜0.05)，C组与B组相比，血糖、BUN和尿蛋白降低，Ccr升高(P ＜0.05)，见 Tab 1。

2.2 肾组织病理学检查 光镜下A组肾组织未见病理改变，B组大鼠肾小球细胞外基质略增生，肾小管上皮细胞肿胀，可见空泡变性，部分萎缩或扩张。C组与B组相比病变明显减轻。

Tab 1 Serum glucose，BUN，Ccr and 24 h urinary protein excretion in group A，B and C(n=10)

2.3 免疫组织化学检测 PCNA、GRP78及Caspase-12在肾脏定位表达:PCNA、GRP78、Caspase-12在正常对照组大鼠肾皮质均有表达，PCNA阳性细胞为细胞核呈棕黄色，在100倍视野中连续不重叠的计数100个肾小管的细胞总数和阳性细胞数及50个肾小球的阳性细胞数，以肾小管细胞的阳性率和单个肾小球切面的阳性细胞数作为比较指标。3组肾皮质小球、小管内均可见阳性细胞，差别无统计学意义。GRP78在A组弱表达，主要位于远端小管和集合管上皮细胞胞质内;B组表达明显增多增强，尤以近曲小管胞质最为明显，部分肾小球内细胞胞质也呈强阳性表达。Caspase-12 A组有表达，主要位于肾小管上皮细胞胞质内，B组表达明显增强，小管及小球内均可见阳性表达。C组GRP78、Caspase-12表达部位与B组大致相同，程度介于A组、B 组之间(见 Fig 1、2)。

Fig 1 Immunohistochemical staining of GRP78 protein in renal cortex at 8 week (×100)A:Control group;B:Diabetic group;C:Treatment group

Fig 2 Immunohistochemical staining of Caspase-12 protein in renal cortex at 8 week (×100)A:Control group;B:Diabetic group;C:Treatment group

2.4 流式细胞术检测细胞凋亡程度及对GRP78和Caspase-12半定量分析结果 B组细胞凋亡率、GRP78及Caspase-12表达程度较A组明显增高，C组细胞凋亡率、GRP78及Caspase-12表达较A组有所增高，但较B组明显降低，见Tab 2。

Tab 2 The expression of GRP78，Caspase-12 protein and apoptosis by flow cytometry

2.5 TUNEL定位检测肾脏凋亡细胞 A组肾小管偶见凋亡细胞，B组细胞凋亡数明显增高，小球、小管内均有阳性表达，但主要位于小管上皮细胞，尤以皮髓质交界处多见，C组凋亡细胞较B组有所减少(Fig 3)。

Fig 3 The apoptotic cells in renal cortex at 8 week (TUNEL staining×100)A:Control group;B:Diabetic group;C:Treatment group

3 讨论

肾素－血管紧张素系统(RAS)对血压调节和水、电解质平衡起重要作用，血管紧张素肽Ⅱ(AngⅡ)是RAS的活性成分，在糖尿病肾病发生发展过程中发挥重要作用。除经典的调节血流动力学效应外，AngⅡ可导致ECM聚积和TGF-β表达明显增加，刺激氧自由基及细胞因子的释放，抑制一氧化氮(NO)合成［2］，除此之外还可以介导细胞凋亡。AT1RA氯沙坦可以阻断Ang II与其受体结合，具有良好的肾脏保护作用［3－5］，本实验糖尿病大鼠8 wk时，肾功能下降，凋亡细胞数明显增加，肾小球和肾小管PCNA阳性细胞数差别无统计学意义，提示8 wk DM组大鼠肾脏细胞过度凋亡，氯沙坦治疗组大鼠肾功能较糖尿病组明显好转，凋亡细胞数大大降低，证实了它的肾脏保护作用，并且这种作用部分通过抑制细胞凋亡实现。

ERS是近年发现的一条新的内在凋亡途径，在糖尿病脏器损害过程中普遍存在。内质网(ER)对内环境的改变高度敏感，缺血缺氧、错误折叠蛋白的积聚、炎症因子等都可干扰内质网正常生理功能，这种亚细胞器病理状态称为ERS。适度的ERS可以恢复ER及内环境稳态，保持细胞活性，但过强或过长时间的ERS将最终导致细胞凋亡。AngⅡ本身及其后续多种生物学效应均可作为应激源诱导ERS，检测ERS标志蛋白GRP78及特有凋亡途径Caspase-12的表达，分析DM大鼠肾组织局部ERS状态，旨在更深入的探讨AT1RA氯沙坦的肾脏保护作用的潜在机制。

78 000 u-糖调节蛋白(78 000 u glucose-regulated protein GRP78)属于热休克蛋白(HSP70)家族，是内质网分子伴侣蛋白，通过与内质网应激元件PKR、IRE1以及ATF6的结合抑制ERS的激活，在未折叠蛋白反应中发挥主要调控作用，GRP78的诱导广泛被认为是ERS的标志性分子［6］。结果显示，糖尿病组GRP78表达高于对照组，主要位于肾皮质近曲小管，部分肾小球也有表达。而氯沙坦治疗组GRP78表达明显下调，提示氯沙坦治疗减弱了糖尿病大鼠肾组织局部ERS状态。

Caspase-12定位于ER外膜，属于Caspase亚家族成员，ERS时，细胞内Ca2+水平增高，引起胞质内钙蛋白酶(calpain)活化并转位ER膜，激活Caspase-12，活化的Caspase-12在无需细胞色素C参与的情况下可以进一步激活Caspase-9和Caspase-3引起凋亡，是独立于膜受体或线粒体凋亡途径的ERS特有凋亡途径［7］。转染了抗Caspase-12抗体的猪肾小管上皮细胞系LLC-PK细胞可以有效的抵抗顺铂诱导的凋亡［8］，是介导ERS凋亡的关键蛋白酶。DM组大鼠肾组织中Caspase-12表达较正常对照组明显上调，氯沙坦治疗组Caspase-12表达尽管没有恢复到正常水平，但较DM组表达下降，并伴有肾组织凋亡细胞数明显减少，提示氯沙坦的肾脏保护作用可能是部分是通过抑制过强的 ERS，进一步抑制Caspase-12的活化，减少细胞凋亡而发挥的。尽管这种作用机制尚未完全清楚，推测可能与下列因素有关:①AT1RA阻断AngⅡ与其受体结合，改善肾血流状态，缓解肾小球内高压及缺氧，稳定内环境，有效逆转ERS，从而减少凋亡发生。②AngⅡ可与胞膜受体结合，使受体依赖钙离子通道开放，致细胞内钙离子聚积［9］，可以刺激氧自由基及细胞因子的释放［10］等，都可以作为应激源诱发 ERS，AT1RA 抑制其与受体结合，从根本上减少应激源的产生，减弱了ERS强度，抑制了ERS特有凋亡途径，从而发挥了肾脏保护作用。

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