除草剂丁草胺对中国林蛙胚胎及胚后发育的毒性作用

刘 伟,赵 艳,边邵康,赵春盛,王丽文

(1.辽宁医学院畜牧兽医学院,中国 锦州 121001;2.沈阳师范大学化学与生命科学学院,中国 沈阳 110034)

丁草胺[2-氯-N-(2.6-二乙基笨基)-N-(丁痒甲基)乙酰胺]，是一类酰胺类除草剂，因其具有高效、低毒、价廉等特点而被广泛地应用于各水稻田中[1]．除草剂的应用，极大地减少了劳动强度，直接或间接地提高了农业生产水平．由于除草剂多为有一定残效期的化合物，且可在生物体内富集，因此其对生态环境的影响已引起世界各国的重视．两栖动物因其自身皮肤裸露、渗透性强的生理和结构的特点，极易受到环境的影响，是一类水环境质量的指示生物[2]．目前，两栖类种群在全球范围内呈现出衰退的趋势，除草剂等农药的大量使用可能是造成环境污染，引起两栖类种群衰退的主要原因之一[1,3]．

中国林蛙(Ranachensinensis)，俗称哈士蟆，隶属于两栖纲，无尾目，蛙科，林蛙属．是我国的重要经济蛙类，是一种集药用、食补、美容三种兼容的经济动物，被誉为深山老林珍品、滋补健身极品．本实验旨在通过丁草胺对中国林蛙胚胎及胚后发育的影响以及林蛙胚胎对丁草胺的耐受性的研究，探讨除草剂丁草胺对中国林蛙胚胎及胚后发育的毒性作用以及对环境、人类可能造成的潜在毒害，为除草剂的安全、合理使用，为林蛙的养殖提供可靠的科学依据．

1 材料和方法

1.1 材料

实验所用的中国林蛙胚胎取自辽宁省岫岩地区，早期胚胎为自然产出的，发育时期大多处于囊胚期；胚后发育所用蝌蚪为实验室自然孵化．实验所用的水是曝气后的自来水；实验温度是在室温下(22±2) ℃进行的；除草剂丁草胺由大连孟山都公司制造，为体积分数为60%的丁草胺乳油．

1.2 方法

1.2.1 除草剂丁草胺对中国林蛙胚胎发育的毒性作用 根据除草剂丁草胺在稻田中施用的浓度将除草剂分别配制成稻田组、稻田2倍组和稻田3倍组3种试验用液，其浓度分别为3,6,9 mg/L．将中国林蛙受精卵(囊胚期)随机分成4组，3个实验组和1个对照组，每组为130枚，分别放入盛有曝气的自来水和试验用液的培养皿内，每个培养皿中放65枚．各浓度溶液为30 mL．为保证药液的浓度和水中的氧含量，24 h更换试验用液一次．在连续变倍双目体视解剖镜下连续观察受精卵的变化过程，记录其发育各个时期持续的时间及测量胚体长度．胚胎发育的分期标准以陈伟庭、李东风等人[4]的报告为依据．

1.2.2 除草剂丁草胺对中国林蛙胚后发育的毒性作用 根据郑晓晶的壬基酚对中国林蛙蝌蚪的急性毒性和雌激素效应[5]中的方法，将孵化出的林蛙蝌蚪随机分为4组，每组30只，分别放入盛有曝气的自来水和试验用液的培养皿内，每个培养皿中放蝌蚪10只，观察中国林蛙蝌蚪暴露在0.17,0.20,0.24 mg/L浓度的除草剂丁草胺中24,48,96 h的致死、致畸及滞育效应(每个时间各观察10只)．各浓度溶液仍均为30 mL，为保证药液的浓度和水中的氧含量，每24 h更换药液一次．

实验结果用Excel统计分析并作图，以平均值和标准差表示, 各组实验结果的差异用t检验比较分析．

2 结果2.1 除草剂丁草胺对中国林蛙胚胎发育的毒性作用

2.1.1 除草剂丁草胺对中国林蛙胚胎发育时间的毒性作用 除草剂丁草胺对中国林蛙胚胎发育时间的毒性作用见图1．图1表明除草剂丁草胺对中国林蛙胚胎发育时间的毒性作用较小．在原肠期随着丁草胺浓度的增加，发育时间缩短；而到了尾芽期和肌肉效应期时，随着丁草胺浓度的增加，发育时间延长；在胚胎最后的出膜期，胚胎发育速度加快，但差异均不显著(P>0.05)．对照组中国林蛙胚胎从囊胚期发育到脱膜期历时73.9 h，而染毒组发育时间分别为74.0,74.4,73.6 h，差异不显著(P>0.05)．

2.1.2 除草剂丁草胺对中国林蛙胚体长度的毒性作用 除草剂丁草胺对中国林蛙胚体长度的毒性作用见图2．除草剂丁草胺对中国林蛙的胚体长度的毒性作用与对发育时间的毒性作用相似．在尾芽期、肌肉感应期和出膜期胚体长度减小，但差异均不显著(P>0.05)．

2.2 除草剂丁草胺对中国林蛙胚后发育的毒性作用

除草剂丁草胺对中国林蛙胚后发育的毒性作用见表1、表2和图3．由表1可以看出，除草剂丁草胺对中国林蛙胚后发育具有明显的致死、致畸和滞育效应．丁草胺浓度为0.17 mg/L在24 h时出现死亡2只，浓度为0.24 mg/L在48 h和96 h各死亡1只，浓度为0.20 mg/L时没有死亡．除草剂丁草胺对林蛙胚后发育具有明显的滞育效应，且随着染毒浓度和染毒时间的增加而加大．表1中可以看出，蝌蚪的滞育数量在丁草胺浓度为0.17 mg/L 24 h时无滞育发生；而丁草胺浓度为0.20 mg/L和0.24 mg/L时，在3个时间段都出现了6只和5只的滞育蝌蚪．且在染毒24 h和48 h，蝌蚪滞育和染毒浓度的剂量关系较为明显，而在染毒96 h，各浓度的滞育效应基本一致(见表2)．

1囊胚期 2原肠期 3神经板期 4神经褶期 5神经管期 1囊胚期 2原肠期 3神经板期 4神经褶期 5神经管期6尾芽期 7肌肉效应期 8心跳期 9 鳃血循环期 10脱膜期 6尾芽期 7肌肉效应期 8心跳期 9 鳃血循环期 10脱膜期图1 除草剂丁草胺对中国林蛙胚胎发育时间的影响 图2 除草剂丁草胺对中国林蛙胚体长度的影响

丁草胺浓度/(mg·L-1)胚胎总数24 h48 h96 h正常胚胎死亡胚胎滞育胚胎畸形胚胎正常胚胎死亡胚胎滞育胚胎畸形胚胎正常胚胎死亡胚胎滞育胚胎畸形胚胎对照组3010000901090100.17305203502340330.20304060406140630.2430505051414153

注：表中死亡滞育畸形等胚胎的数目总和大于10，是因为有些胚胎既滞育又畸形.

表2 除草剂丁草胺对中国林蛙胚后发育滞育的影响 mm

除草剂丁草胺致中国林蛙胚胎畸形的主要形式见图3．脊椎弯曲：胚体的脊椎不是位于一条直线上，尾部向一侧弯曲；尾部畸形：尾巴没有明显的形状或弯曲短小，大部分尾部畸形与其他的畸形效应同时出现；腹部畸形：腹部肿大积水，并出现器官消失状态持续一定时间胚胎死亡；体形不规则．

A.脊椎弯曲 B.腹部肿大尾巴短小 C.腹部畸形(充水) D.尾巴弯曲腹部肿胀 E.体形不规则(头部) F.正常蝌蚪图3 畸形胚胎的各种形态

3 讨论

除草剂丁草胺对中国林蛙胚胎发育的时间和胚体长度的毒性作用可能和除草剂在体内的富集有关，与除草剂在鱼类体内的富集相似[6]．酰胺类除草剂主要通过杂草幼芽和幼根所吸收，在杂草内进行运输，抑制细胞内蛋白质的合成而使杂草死亡[7]．尾芽期和肌肉效应期是胚体生长速度最快、发育时间较长的时期，随着丁草胺浓度的增加和染毒时间的延长，丁草胺在胚胎的富集而抑制了胚胎蛋白质的合成，从而使胚胎发育时间延长，胚体缩短．而除草剂丁草胺使原肠期和出膜期的胚胎发育时间缩短，可能与原肠期发育时间长，丁草胺在胚胎早期的富集和脱膜期卵胶囊的破坏，导致丁草胺的大量进入而产生的应激效应有关．但除草剂丁草胺对中国林蛙胚胎发育的时间和胚体长度的毒性作用均较小，且无显著差异，这与杨晓梅等用乙草胺处理中华大蟾蜍早期胚胎得到的结果相似[8]，可能与中国林蛙受精卵的卵胶囊的结构和性质及耐受程度起保护作用有关．林蛙的卵胶膜内外两层清晰可分辨，胶膜的主要成分是粘多糖(酸性和中性)、一些单糖、蛋白质和唾液酸等物质．多种两栖动物胶膜中还含有特异性组成成分和许多不同的抗原，这些结构使胶膜可保护受精卵不受机械刺激和外来有害物质的影响．当发育到出膜期，由于没有卵胶囊的保护作用，胚胎对除草剂丁草胺的耐受性大大降低，导致胚胎大量死亡．中国林蛙胚胎从囊胚期发育到脱膜期的发育时间变化不大，与李东风、陈伟庭的中国林蛙早期胚胎发育中计算从囊胚期到出膜期的72.5 h基本相同[4]．

除草剂丁草胺对中国林蛙胚后发育的毒性作用明显强于胚胎发育．浓度较正常稻田使用低得多的丁草胺就对中国林蛙胚后发育具有明显的致死、致畸和滞育效应．各种畸形与侯立静等研究丙线磷对中华大蟾蜍早期胚胎发育的影响的畸形效应基本一致[3]．这可能是由于缺少了卵胶囊的保护作用，除草剂丁草胺等化学因子通过渗透作用而直接影响中国林蛙的蝌蚪，使其正常新陈代谢功能和特定的蛋白质合成及基因表达过程遭到抑制．

作者的实验结果表明，除草剂丁草胺对中国林蛙胚胎发育的毒性较小，而对出膜后的蝌蚪具有较强的毒性作用，较低浓度的除草剂就会产生较强的致死、致畸和滞育效应．因此，在农业生产中，在一定程度上限制除草剂等有害农药的使用对于两栖动物的保护是十分必要的．

参考文献：

[1] 姚 斌，徐建民，张超兰.除草剂丁草胺的环境行为综述[J].生态环境, 2003,12(1)：66-69.

[2] 储昭霞，席贻龙，徐晓平,等. 除草剂草甘膦对萼花臂尾轮虫生活史特征的影响[J].应用生态学报, 2005,(6)：1 142-1 145.

[3] 侯立静，杨晓梅,马 跃，等.丙线磷对中华大蟾蜍早期胚胎发育的影响[J].农业环境科学学报, 2005,24(4)：682-685.

[4] 陈伟庭，李东风.中国林蛙早期胚胎发育观察[J].华南师范大学学报：自然科学版, 2005,(3)：40-45.

[5] 郑晓晶.壬基酚对中国林蛙蝌蚪生长发育的毒性效应[J].生态学杂志, 2008,(8)：1 332-1 336.

[6] RIBAS G, CARBONELL E, CREUS A,etal. Genotoxity of humic acid in cultured human lymphocytes and its interaction with the herbicides alachlor and maleic hydrazide[J].Environ Molec Mut, 1997,29(3)：272-276.

[7] 何 林，邓新平，王进军,等.几种酰胺类除草剂毒力、药效及安全性评价[J].农药,2002,41(12)：36-38.

[8] 杨晓梅,谭志军，苑 怡，等.乙草胺对中华大蟾蜍早期胚胎发育的影响[J].动物学报, 2001,47(S1)：25-30.