用5′加尾长引物进行AFLP片段的直接测序

刘耘，陈勋，李强

(1.华中农业大学 动物科技学院，湖北 武汉 430070;2.华中农业大学 作物遗传改良国家重点实验室，湖北 武汉 430070)

AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)是基于DNA限制性片段选择性扩增的分子标记技术[1].其主要技术流程如下：首先用一种识别六碱基与一种识别四碱基的限制性内切酶如EcoRI和MseI消化基因组DNA，酶切产物与接头连接，连接产物经预扩增后，再用含接头、酶切位点及3个特异碱基的选择性引物对预扩增产物进行选择性扩增.扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染显色，获得多态性AFLP标记.AFLP标记具有DNA用量少、信息量多、不需要预先知道扩增基因组的序列信息以及物种之间可通用等优点.

自AFLP标记技术发明以来，已广泛应用于DNA指纹分析、种质资源遗传多样性分析、基因定位、遗传作图、分子标记辅助育种等研究中.由于AFLP技术能够在一次PCR反应中检测大量的遗传位点，而且不需要知道目标基因区段的基因组序列信息，因此特别适合于与BSA分析(Bulked Segregant Analysis)技术[2]相结合寻找与目标基因紧密连锁的分子标记.例如，Yi等[3]用2560对AFLP引物结合BSA方法筛选与隐性核不育基因紧密连锁的分子标记，获得7个与隐性核不育基因Bnms1紧密连锁的AFLP标记，为Bnms1基因的克隆奠定了基础.由于AFLP过程比较繁琐，不适合于大群体的高通量筛选.通常，人们先将与目标性状连锁的AFLP标记测序，再将AFLP标记转化成位点特异的STS(Sequence-Tagged Sites)、CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequences)或SCAR(Sequence-Characterized Amplified Region)标记，然后再进行高通量检测.AFLP标记片段测序有两种策略：第一种策略是先将AFLP标记回收克隆，再与T/A克隆载体连接，挑3个以上阳性克隆进行测序，通过序列拼接获得无错误的标记序列[4].这种方法耗时较长，成本也较高.第二种策略是回收AFLP标记片段，再用原来的选择性引物扩增，将得到的PCR产物直接测序.但是，测序的前30个核苷酸通常无法读出或质量较差，需要从两端分别测序，增加了实验成本.

本研究中，我们报道一种AFLP片段快速直接测序方法，只需一次测序反应就能获得AFLP标记片段的全序列.

1 材料与方法

1.1材料本研究所用的油菜品种为中油821(黑籽)和人工合成甘蓝型油菜品系No.2127(黄籽)，分别从田间取新鲜叶片提取基因组DNA.

1.2 AFLP分析用EcoRI和MseI消化中油821和No.2127总DNA[4]，AFLP操作流程参考陆光远等[5]的程序进行.

1.3扩增产物的电泳和凝胶染色AFLP预扩增产物分别用选择性引物组合E+AAA/M+CAC，E+AAT/M+CAC，E+AAC/M+CAC，E+AAG/M+CAC，E+ATA/M+CAC和E+ATT/M+CAC扩增(其中E的序列为GACTGCGTACCAATTC，M的序列为GATGAGTCCTGAGTAA).AFLP扩增产物的电泳分离参照文献[6]方法进行.取选择性扩增的PCR产物4 μL上样，85 W电泳2 h.电泳完毕，小心剥下胶板，用改进的Bassam法染色[7].

1.4 AFLP标记片段的回收在聚丙烯酰胺凝胶上选择要回收的AFLP条带，按Liu等[8]的方法进行回收和再扩增.具体操作如下：用刀片轻轻将AFLP条带挖下来，并转入0.5 mL离心管中，加入50 μL ddH2O，然后用一次性无菌吸头捣碎，沸水煮沸10 min，再离心2 min(8 000 r/min)，取上清液作DNA模板.

1.5 AFLP标记片段的再扩增AFLP片段再扩增反应包括一条AF2SC引物和一条选择性引物.AF2SC是EcoRI接头端的引物，其序列为CAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCT-TGCTCGTAGACTGCGTAC，共52个碱基，其中下划线部分为通用的M13RV测序引物序列，斜体部分为EcoRI接头序列.MseI接头端引物为各AFLP片段的选择性引物，包含MseI接头的核心序列和3个选择性碱基.回收的AFLP片段用如下反应体系进行再扩增：取6 μL回收的AFLP片段上清液，0.2 mmol/L AF2SC，0.2 mmol/L MseI接头端选择性引物，2.0 mmol/L Mg2Cl，0.1 mmol/L dNTP，1×Taq DNA聚合酶缓冲液，1.5 U Taq DNA聚合酶，反应体积为25 μL.PCR循环条件为94 ℃预变性3 min，然后经94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环35次，最后在72 ℃延伸5 min.PCR产物在1%琼脂糖凝胶上检测，扩增片段清晰的PCR产物用于DNA直接测序.

1.6 DNA片段的直接测序在进行DNA测序反应前，先用虾磷酸化酶和核酸外切酶去除多余的dNTP和引物.反应条件如下：在10 μL的反应体系中，加入5 μL PCR产物，1.25 U核酸外切酶，0.65 U虾磷酸化酶，在37℃条件下反应1 h，然后在80 ℃保温20 min终止反应.取3 μL处理过的PCR产物进行DNA测序.测序反应按Applied Biosystems公司的说明书进行(ABI,FosterCity,CA,USA).测序反应产物用ABI3130测序仪电泳分离.

2 结果

2.1 AFLP片段直接测序的原理从聚丙烯酰胺凝胶中回收AFLP片段后，直接用加长的AF2SC引物和MseI选择性引物进行再扩增.扩增后，在AFLP片段末端引入了36 bp，其5′末端的18 bp是通用测序引物M13RV序列，在M13RV和EcoRI酶切位点之间是34 bp引入序列和接头序列.直接用M13RV引物对PCR再扩增产物进行测序，前30个质量较差的碱基正好落在已知序列上，而之后的来源于油菜基因组的序列质量比较好.该方法的基本原理如图1所示.

图1 AFLP片段直接测序的原理a.AF2SC引物与AFLP片段的配对；b.用AF2SC和MseI引物进行AFLP片段再扩增；c.扩增后的AFLP片段比原来增加了36 bp.图中带下划线的部分表示M13RV测序引物， 斜体部分表示AF2SC与AFLP片段配对的序列

2.2 AFLP片段扩增和再扩增甘蓝型油菜中油821和No.2127总DNA经EcoRI和MseI酶切后，分别与EcoRI和MseI接头连接，经预扩增后，再分别用选择性引物组合E+AAA/M+CAC，E+AAT/M+CAC，E+AAC/M+CAC，E+AAG/M+CAC，E+ATA/M+CAC和E+ATT/M+CAC扩增.从图2中可以看出，每对引物组合扩增出20～50条AFLP条带，分布在80～400 bp之间(图2).从聚丙烯酰胺凝胶上选择18个清晰的AFLP片段，挖胶回收.然后分别用AF2SC和MseI选择性引物再扩增，每个AFLP片段都扩增得到清晰的条带(图3).

图2 AFLP标记的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果

图3 AFLP片段回收后再扩增结果 泳道1～18是不同AFLP片段再扩增的 PCR产物，M为分子量标记 GeneRuler 1 Kb DNA ladder (Fermentas).

2.3 AFLP片段的测序将上述扩增得到的PCR产物经核酸外切酶和虾磷酸化酶消化，然后用M13RV引物直接进行测序.从测序结果可以看出，前30个碱基序列质量相对较差，随后质量较好.经过序列比对，每个片段的5′端都可以找到接头序列、EcoRI酶切位点和3个选择性碱基.在其3′末端也可以找到3个选择性碱基、MseI酶切位点和接头序列.表明利用该方法，只需一次反应就能将AFLP片段序列完全测通(图4).

图4 AFLP片段再扩增产物直接测序的结果

3 讨论

在作物重要农艺性状基因的定位与克隆研究中，通常利用AFLP技术筛选与目标基因紧密连锁的分子标记，然后用紧密连锁的AFLP标记分析大群体，筛选重组单株[3].但是，由于AFLP标记技术比较繁琐，不适合于对大群体进行高通量分析.必须将AFLP标记转化成STS、CAPS或SCAR标记，才能用于大群体重组单株的高通量筛选.而转化成STS、CAPS或SCAR标记的前提是先测定AFLP片段的序列.目前，AFLP片段的两种测序策略比较费时，而且实验成本也比较高.用5′末端长引物对AFLP片段进行再扩增后，在AFLP片段中引入来一段已知序列.用引入片段的5′末端序列对再扩增产物进行直接测序，只需一次反应就能获得AFLP片段的序列，大大缩短了时间，降低了实验成本.

参考文献：

[1] Vos P,Hogers R,Bleeker M,et al.AFLP: a new technique for DNA fingerprinting[J].Nucleic Acids Res,1995,23: 4407-4414.

[2] Michelmore RW,Paran I,Kesseli RV.Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis: a rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations[J].Proc Natl Acad Sci,1991,88:9828-9832.

[3] Yi B,Chen Y,Lei S, et al.Fine mapping of the recessive genic male-sterile gene(Bnms1) inBrassicanapusL[J].Theor Appl Genet,2006,113:643-650.

[4] Xiao S,Xu J,Li Y,et al.Generation and mapping of SCAR and CAPS markers linked to the seed coat color gene inBrassicanapususing a genome-waling technique[J].Genome,2007,50: 611-618.

[5] 陆光远，杨光圣，傅廷栋.甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育基因的AFLP标记[J].作物学报,2004,30: 104-107.

[6] 刘耘，熊家军，杨利国.2 种方法银染的 AFLP片段再扩增效果比较及改进 [J].华中农业大学学报，2008，27：182-185.

[7] Bassam G C,Gresshoff P M.Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels[J].Anal Biochem,1991,196: 80-83.

[8] Liu Z,Fu T,Wang Y,et al.Development of SCAR and CAPS markers for a partially dominant yellow seed coat gene inBrassicanapusL[J].Euphytica,2006,149: 381-385.