电纺羧甲基壳聚糖复合rhBMP-2生长因子纤维膜的制备*

唐 涛 谢 彤 齐宏旭 胡 平

引导组织再生(GTR)用于牙周组织缺损修复。此方法将一种屏障材料置于牙根和牙龈瓣之间，阻挡牙龈结缔组织细胞和上皮细胞与牙根先接触，保证牙周膜组织来源细胞和牙槽骨细胞优先占据牙根面而生长，使组织修复再生能力得到最大限度发挥。静电纺丝是制备超细纤维的一种重要方法，得到的电纺纤维具有直径小(几纳米至几微米)、比表面积高等特点。静电纺丝过程是将具有一定粘度的高分子溶液或熔体置于带有金属毛细管喷头的装置中，在高压电场的作用下，处于喷口的液滴克服表面张力形成喷丝细流，在到达接收装置之前，细流不断分裂细化及溶剂挥发,最后形成电纺纤维。若液体在连续的推动供给下，可得到一定厚度的超细纤维膜。本文利用静电纺丝技术用羧甲基壳聚糖复合生长因子(rhBMP2)缓释微球制备牙周组织再生引导膜具有临床指导意义，并研究其释药特点。

1.实验材料和设备

1.1 主要试剂 羧甲基壳聚糖(山东医疗器械研究所Mw=50万)；二氯甲烷(韦斯实验用品有限公司A.R.)；纳米羟基磷灰石(清华大学核研院)；聚乙烯醇(百灵威科技有限公司A.R)；气溶胶(AOT)(北京化学试剂公司A.R.)；氯化钙(韦斯实验用品有限公司)； 海藻酸钠(Alg)(北京化学试剂公司)；生长因子(rhBMP2)(军事医学科学院)。

1.2 主要实验仪器设备 光电天平(DT-100)(北京光学仪器厂)；电磁搅拌加热套(DHS)(山东华鲁电热设备有限公司)；真空干燥箱(ZK-82B)(上海实验仪器厂)；扫描电镜(s-5500)(日本Hitachi公司)；显微数码照相系统(DP50)(日本Olympus公司）。

1.3 方法

1.3.1 载药微球的制备及电镜表征

乳化剂：气溶胶即双-[2-乙基己基]-琥珀酸磺酸钠(AOT)；

药物载体：海藻酸钠（溶有生长因子即骨形态发生蛋白(rhBMP)，其含量不超过0.5%)；

交联剂：氯化钙；

实验步骤：把0.5g AOT溶于25ml的二氯甲烷中，再逐滴加入3ml 1.0 wt%的海藻酸钠溶液。在1200转/s的转速下搅拌10min后，再逐滴加入1ml 5wt%的氯化钙溶液。继续搅拌10min；最后得到的油包水的溶液。即完成钙藻酸盐微球对生长因子进行载药的制备。其中的小球平均直径为(7±2)um。为了在海藻酸钙微球中负载生长因子，一定质量的生长因子提前溶解到海藻酸钠水溶液中。扫描电镜下电压为20kv×2000倍和4000倍照片表征见图1。

1.3.2 羧甲基壳聚糖引导牙周组织再生纤维膜的制备及电镜表征 首先采用精制的聚乙烯醇为单体与羧甲基壳聚糖等比混合成纺丝溶液。再将液相共沉淀法制备的纳米级羟基磷灰石溶解后，加入上述配成的混合纺丝溶液中，机械搅拌后，通过超声分散，即得纤维主体可降解的羧甲基壳聚糖羟基磷灰石混合溶液。然后将载药后钙藻酸盐微球混入此溶液中，得到具有一定粘度的高分子溶液。

本实验将上述浓度为3-12wt%的高分子溶液置于带有金属毛细管喷头的装置中，在高压电场的作用下，处于喷头的液滴克服表面张力形成一股带有电荷的喷射流。在到达接收装置前，喷射流逐渐被拉长变细及溶剂挥发，最后形成“串珠”丝状结构的电纺纳米纤维。静电纺丝过程于室温下，用0.9mm平头针，10-20kv的电压，8-15cm的距离进行，纤维在接地的铝泊上收集，直到纤维膜的厚度达到所需要求，即得羧甲基壳聚糖引导牙周组织再生纤维膜。样品进一步处理后在扫描电镜下电压为20kv×500倍和2000倍观察见图2，膜的实物照片见图3。

1.3.3 体外释药实验 体外释放是在0.9%的氯化钠水溶液中进行，精确称一定量的电纺丝纤维膜放到离心管里，再加入10ml释放介质。每个样品重复测量3次取其平均值，每条释放曲线的样品来自于同一个纤维膜的不同部分。离心管被放到37℃的水浴摇床中，选择每隔20hr的时间间隔取出试样。生长因子的浓度用紫外分光光度计测定。

图4所示的体外释放结果显示，

2.结果

用静电纺丝技术将载药后钙藻酸盐微球与主体羟基磷灰石羧甲基壳聚糖混合制得了具有“串珠”丝状结构的复合纤维膜图3。

体外释放试验曲线看出约在50hr时微球的释放速率约为96%，复合纤维膜的释放速率约为78%，50hr之后两者释放接近平缓。

3.讨论

牙周引导组织再生的核心是通过在牙根面与龈瓣之间放置生物屏障膜以引导牙周组织再生，而GTR在恢复牙周组织的生理结构功能、材料性能和对一些牙周较大缺损的修复再生上还远未达到所期望的目标[1,2]。本实验采用的纤维膜材料则具有良好的生物相容性和降解性，其一方面能诱导牙周组织生长，另一方面能阻挡结缔组织和上皮细胞进入牙周组织缺损区域。

羧甲基壳聚糖是壳聚糖的衍生物，水溶性，具有杀菌消炎作用，良好的生物相容性和生物降解性，可引导组织再生重建，降解吸收，不必二次手术取出[3]。卢凤琦[4]进行生物学评价其无细胞毒性、不溶血、不致热、不致敏，具有很好的表面相容性和机械性能。吴勇[5]报道壳聚糖膜的降解性能基本符合牙周组织再生要求。羟基磷灰石是人体自然骨的主要成分，具有良好的生物相容性和骨诱导性[11]，提高了膜的力学性能和拉伸强度。由于单纯的羧甲基壳聚糖溶液静电纺丝效果不佳，经过加工羧甲基壳聚糖共混的乙烯醇和羟基磷灰石，通过分子间的氢键及其良好的相容性来改善羧甲基壳聚糖的可电纺性[6]。

在制备中通过改变电纺参数如电压、喷丝口与接收屏之间的距离、纺丝液的流量以及溶液浓度、表面张力和电导率等，可控制纤维直径的粗细，膜的厚度，孔隙率等，根据牙周引导组织再生特性可以设计出多种功能的梯度结构膜材料。

本试验制备的膜将参照庄昭霞、吴勇[4,5]等文献介绍的方法对其进行生物学评价、膜降解时间和机械性能等测试，能否达到牙周组织引导再生的要求将另文报道。

图1中看到大小不一的微球，可能是因溶液浓度的不均一，且没有充分搅拌均匀等影响因素而得，但通过筛分可滤出大小一致的微球。因没有更高倍的扫描电镜图所示，尚需进一步研究影响因素予以补充说明。

图4中表明的释放初期2个样本中都观察到突释现象。这可能是由于蛋白被吸附到表面或者在表面上松散的聚集。rhBMP2从纤维中的释放始终比微球中的释放缓慢，突释降低，显示出延长的释放效果，约在50h以后药物释放速率缓慢，纤维与微球降解速率接近平稳，释放行为遵守药物控释机制，起到缓释作用。这是因为纤维外层对内部药物渗透的阻碍作用。另外，也证明载药微球被包复到纤维当中，和其他成熟的制备微胶囊的技术(例如溶剂挥发和喷雾干燥技术)相比，电纺丝的方法具有竞争和互补的优势。

生长因子(即重组人骨形态发生蛋白rhBMP2)是一类小分子蛋白，在血液和组织中含量微小，具有多种调节功能,在组织修复过程中调节细胞的增殖、趋化、分化和细胞外基质的生物合成等，能明显促进牙周组织的再生和修复[7]。缓释微球系统可以避免蛋白类药物体内降解失活和药物的突释作用，减少用药量和药物的副作用[8]。本实验采用钙藻酸盐微球包裹生长因子以“串珠”丝状特殊结构复合到电纺纤维中，能增大药剂的表面积，其随纤维降解而缓慢持续地释放出来，有效地保证其在缺损局部的治疗浓度和作用时间，最大限度地发挥药物的功效[9]。

将药物控释技术引入牙周组织再生术还能让膜材料负载抗生素及各种生长因子，既有效控制牙周炎症，改变传统的牙周给药方式，减少药物副作用，又可向种子细胞定量、持续释放，为口腔组织工程提供种子细胞[10]。电纺纤维不仅单独用于控制释药，还用作组织工程中的生物模板，释放生长因子以辅助牙周组织细胞的生长和分化。因此纤维膜携带生长因子等成分并用作组织工程支架，进一步丰富电纺丝的研究范围和其在生物医用材料领域的应用前景。

目前这种含有生长因子缓释系统的再生膜还处于实验室研究阶段,许多问题亟待解决。该膜是否可以应用于临床尚需要生物学性能测试和评价。

3.结论

用静电纺丝技术平台制备缓释再生引导膜是可行的，这一技术为牙周组织再生术的完善和发展提供新的研究空间。

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